Development of a 3D matrix for the culturing of adult tissue stem cells for therapeutic purposes
Doel en voorlopige uitkomsten van het onderzoek
Het onderzoek had als doel een synthetische matrix te ontwikkelen, waarin organoïden kunnen groeien. Organoïden zijn meercellige weefsels; verkleinde en versimpelde versies van organen die buiten het lichaam zijn gekweekt. Ze kunnen gebruikt worden om menselijk weefsel te repareren. Momenteel is er een matrix beschikbaar: Matrigel®, een product dat door Engelbreth-Holm-Swarm-muissarcoomcellen wordt gemaakt. In die substantie, die de extracellulaire matrix in het lichaam nabootst, kunnen cellen goed groeien. Maar omdat het een dierproduct is waarvan de samenstelling niet 100% bekend is, is het niet geschikt voor klinisch gebruik. De wens was een synthetische component te ontwikkelen die volgens Good Manufacturing Practices (GMP) te maken is, zodat die te gebruiken is voor humane toepassing.
Rob Coppes: “Daartoe zijn we een synthetische hydrogel gaan doorontwikkelen en testen, die geen dierlijke oorsprong heeft en in mensen is toe te passen. Organoïden bleken in die gel redelijk goed te kunnen groeien. Ons doel was dat organoïden zich in de gel zouden gaan vermenigvuldigen. De initiële groei was prima, maar het vermenigvuldigen bleek niet goed mogelijk. Uiteindelijk is er een aanvullend project nodig om deze gel zover te krijgen dat die ook voor onze toepassing geschikt is. De Radboud Universiteit is in principe bereid om over een vervolgonderzoek te praten. Het bedrijf dat de gel GMP moet maken, is er nog niet helemaal klaar voor maar wel geïnteresseerd in een voortzetting.”
Rob Coppes
Rob Coppes is projectleider van één van de LSH2Treat projecten en hoogleraar Celbiologie aan het Universitair Medisch Centrum Groningen.
Wat kan het product betekenen voor kostenbeheersing in de zorg en verbetering van kwaliteit van de zorg?
Synthetische hydrogel heeft veel voordelen doordat deze in principe aan te passen is aan een specifieke experimentele methode. Daardoor zijn experimenten betrouwbaarder, en zijn er minder experimenten nodig. Dat geldt ook voor eventuele dierexperimenten, wat wetenschappelijk, financiële en ethische voordelen heeft.
Rob Coppes: “Het nu gebruikte Matrigel wordt gemaakt door sarcoomcellen in muizen te laten groeien. Het zou veel muizen schelen als je de gel niet meer op die manier hoeft te maken. Dat is voordelig voor de producent maar zou ook proefdieren schelen. De hydrogel kan ook een gamechanger worden op het gebied van orgaanreparatie en -transplantatie. Mogelijk kunnen de in de gel gekweekte organoïden beschadigde organen in patiënten repareren en orgaantransplantatie wellicht voorkomen. Dat zou kunnen helpen om het gebrek aan donororganen, wachttijden voor patiënten en sterfgevallen op te lossen."
"Binnenkort starten we met de eerste stamceltherapie gebaseerd op organoïden. Onder meer door vanuit ZonMw onder Translationeel Adult Stamcelonderzoek (TAS) gefinancierde projecten waarbij we speekselklier-organoïden gaan transplanteren in patiënten. Momenteel kweken we daarbij organoïden in de Matrigel, reinigen ze en tonen aan dat er geen Matrigel meer in zit, waarna we ze willen inspuiten in de patiënt. Het blijkt voor vergelijkbare toepassingen beter en eenvoudiger om de nu ontwikkelde hydrogel te gebruiken, doordat deze gel mee getransplanteerd kan worden."
Samenwerken met bedrijven
“De bedoeling van 2Treat is bedrijven te betrekken bij de ontwikkeling. In principe werkten we bij de start, meer dan 5 jaar geleden, samen met twee labs die beide organoïden konden groeien. We wilden verschillende organoïden testen in verschillende labs. We hebben een synthetische gel gebruikt van een bedrijf in Groningen en de organoïden daarin getest, wat redelijk verliep. Totdat het bedrijf dat de gel produceerde failliet ging, omdat de financiële support van medewerkende bedrijven en aandeelhouders werd teruggetrokken.” Daarmee werd het project onderbroken.
Coppes: “Toen hebben we een ander bedrijf gevonden dat een andere hydrogel produceerde, die nog beter moest zijn. Dat werkte ook redelijk. Maar helaas liep het op een half jaar van afronding opnieuw mis en viel ook het tweede bedrijf om. De basis is dat je eigenlijk met bedrijven moet samenwerken die enige continuïteit kunnen garanderen. Het bedrijf waarmee je in zee gaat, moet een stevige basis hebben. Misschien zou ZonMw daarin ook een rol in spelen, een soort toetsing bieden.”
Luister goed naar de visie van een bedrijf; die kan je wel eens met twee benen op de grond zetten.
De samenwerking met ZonMw
Coppes beschrijft de ervaring met de samenwerking met name in de fase tussen de twee bedrijven in als positief en beschrijft ZonMw als geduldig en ondersteunend. ZonMw was bereid mee te zoeken naar mogelijkheden. Een van de voorwaarden hield in dat een van de deelnemende bedrijven financieel zou bijdragen. Maar het bedrijf bleek als startup niet bereid dat te doen. De financiële bijdrage werd toen omgezet in een in-kind bijdrage, waardoor het project alsnog in het lab kon worden afgerond.
Rob Coppes: “We zijn een aantal malen op gesprek geweest bij de beoordelingscommissie. Dan krijg je heel kort de tijd voor discussie. Een van de commissieleden was een specialist die wat meer wist over ons onderwerp en goede vragen stelde. Ik had met zo iemand graag wat langer gesproken. Misschien is het een goed idee om wat meer gelegenheid tot gesprek te bieden als iemand relevante expertise heeft. Om wat andere ideeën te genereren, misschien zelfs na de bijeenkomst.”
Tips voor onderzoekers die met bedrijven gaan samenwerken
“Zorg dat je goed weet met wie je in zee gaat en hoe duurzaam dat bedrijf is. En luister naar hun visie; die kan je wel eens met twee benen op de grond zetten. En verder: het is niet simpel om bedrijven volgens de structuur van ZonMw in te delen en het budget kloppend te krijgen. Daarom is het belangrijk een goede ondersteuning van je financiële afdeling te hebben, die eerder met dergelijke constructies te maken hebben gehad, zodat je er niet te veel tijd aan verliest.”
Publiekssamenvatting
The identification of adult stem cells of multiple solid organs has opened tremendous possibilities for regenerative medicine for example to replace organ transplantation and ameliorate tissue dysfunction and improve quality of life. Organoid culture systems have been developed that allow the expansion of genetically and phenotypically stable adult, organ specific, stem cells eliminating the risk of in vitro transformation. However, the expansion of salivary gland and thyroid gland stem cells relies on the use of animal-derived, poorly defined 3D Matrices such as Matrigel, which is a barrier for the clinical use. Therefore, it is necessary to develop a synthetic 3D matrix with specific microenvironments allowing optimal, safe and good manufacturing practice (cGMP)-level expansion of adult stem cells. Noviocell made Noviogel (PIC gel) available for testing of salivary and thyroid gland organoids. Although PIC gel is a synthetic matrix, it offers almost identical biomechanical properties to natural matrices. PIC gel can be fully customized to meet the needs of every cell type by the addition of growth factors (GF) necessary for cell development. Functionalizing PIC gel with several extracellular matrix (ECM) peptides or synthetic integrin recognition tags (RGD tag) or growth factors will significantly enhance the versatility of the hydrogel. The salivary gland and thyroid gland organoid culture systems will be used to study the use of PIC gel for expansion and regenerative potential of salivary and thyroid stem cells. Next, PolyVation aimed to developed a scaled-up process to synthesize the matrix component according to cGMP industry guidelines and with that open up the opportunity for working towards the start of early-stage clinical investigations. The project aims to deliver novel, tailor-made 3D cell culture matrix products and clinical grade expansion protocols of adult stem cells for use in regenerative therapies.
First, Noviocell developed two PIC polymers with different polymer lengths (1K and 5K) and to improve the biocompatibility and cell binding, the polymers were functionalized with peptides, being RGD (fibronectin), DGEA (collagen I / IV), IKVAV (Laminin alfa 1) and YIGSR (Laminin beta 1). These PIC polymers were first tested on the potential to form organoids from mouse salivary gland derived cells. Regretfully, mouse salivary organoids developed poorly in all PIC gels when compared to matrigel. Even addition of extra growth factors known to stimulate stem cells division did not positively influence organoid forming efficiency (OFE) as a measure of stem cell potency. It was noticed that PIC gel was not toxic to the cells but just inhibited growth by inhibiting stem cell functioning. However, from these data it was concluded that PIC-RGD5K (1.0 mg/ml) and PIC DGEA5K (4.0 mg/ml) most promising.
Interestingly, when we tested human salivary glands cell for their potential to grow organoids in PIC gels, we saw to our surprise a better growth than that of mouse organoids. This could be further improved by using PIC-RGD5K (2.0 mg/ml) and the addition of inhibitors of inhibitors of stem cell growth the culture medium, resulting in a comparable organoid formation as in matrigel. However, when stem cell self-renewal potential was assessed by passaging of the cell derived from the organoids, the organoid forming efficiency as measure of stemness was strongly reduced when compared to that observed in matrigel. To assess what factors may be lacking in the PIC gel, bulk RNA-sequencing was performed. Many differential expressing genes were observed between organoids cultured in matrigel compared to PIC gel. The major differentially expressed genes were so-called immediate-early response genes and genes involved in regulation of cell division and differentiation, such as RhoA-actin, ERK and p38 MAPK and P13K. Isoproterenol was used to stimulated these pathways and indeed resulted in an improved organoids formation of human salivary gland derived cells. Similarly, but in an opposite direction removing of Rock-inhibitor Y 27632 from the culture medium resulted in reduction of organoid formation in matrigel to the level of the PIC gel. These data indicate that the differentially gene expression analysis may yield handholds, such as the preventing of premature differentiation, for further optimization of the PIC gel. Or optimize the culture medium for the culture of organoids for clinical use in PIC gels. Interesting human thyroid gland organoids remained functional when transferred from matrigel to PIC gel, indicating that the PIC gels could be further develop into a clinical applicable gel for transplantation purposes of complete organoids.
In the meantime, Polyvation progressed towards GMP manufacturing of the hydrogel. Several chemicals were replaced for more safe, environmental and more (operator) friendly chemicals. Purification steps were performed and mechanical properties were tested. The mechanical properties of hydrogels were within specifications, proving that the optimizations were successful. The current status is a good starting point for a future project towards GMP manufacturing of the
hydrogel.
In conclusion, a potential clinical application of the use of PIC gel for thyroid organoid transplantation was observed and the GMP manufacturing is progressed to a good starting point for further development.