Carbapenem-resistance selection and characterization of Enterobacteriaceae carrying plasmid-encoded AmpC beta-lactamases

Projectomschrijving

Wereldwijd neemt de resistentie van Escherichia coli tegen 3e generatie cephalosporines ten gevolge van plasmidaal gecodeerde β-lactamase enzymen toe. De behandeling van infecties met dergelijke resistente organismen berust veelal op het toedienen van carbapenem antibiotica. Tijdens de behandeling kunnen echter mutanten ontstaan met een verminderde doorlaatbaarheid van de buitenmembraan waardoor organismen tijdens therapie resistent worden voor desbetreffend antibioticum.

Het doel van dit onderzoek is dan ook in vitro de processen te bestuderen die het ontstaan van carbapenem resistentie bevorderen. Hiervoor zullen E. coli organismen in vitro blootgesteld worden aan verschillende antibiotica, verschillende concentraties en gedurende verschillende tijdstippen om zo inzicht te krijgen welke omstandigheden tot carbapenem resistentie leiden. In deze experimenten zal tevens de expressie van relevante genen in combinatie met de permeabiliteit van de buitenmembraan bestudeerd worden.

Producten

Titel: Antibiotic trapping by plasmid-encoded CMY-2 β-lactamase combined with reduced outer-membrane permeability as a mechanism of carbapenem resistance in Escherichia coli
Auteur: W. H. F. Goessens, A.K. van der Bij, R. van Boxtel, J.D.D. Pitout, P. van Ulsen, D.C. Melles and J. Tommassen
Magazine: Antimicrobial Agents and Chemotherapy
Titel: Increased expression levels of chromosomal AmpC ß-lactamase in clinical Escherichia coli isolates and their effect on susceptibility to extended-spectrum cephalosporins
Auteur: S. Paltansing, M.E.M. Kraakman, H.A.M. van Boxtel, I. Kors, E. Wessels, W.H.F. Goessens, J.P. Tommassen and A. T. Bernards
Magazine: Microbial Drug Resistance

Verslagen


Eindverslag

Antibioticum resistentie is een wereldwijd probleem en we zien dan ook behalve een toename in het absolute aantal resistente micro-organismen ook een toename in de diversiteit van resistentie-mechanismen. Een mechanisme van resistentie dat in toenemende mate wordt aangetoond in E. coli bacterien, is de aanwezigheid van plasmidaal gecodeerde AmpC beta-lactamasen. Uit de in het project uitgevoerde prevalentiestudie blijkt dat in 0,1% van E. coli isolaten het mechanisme van plasmidaal AmpC voorkomt. Desbetreffende E. coli organismen zijn hierdoor resistent tegen alle penicillines en cephalosporines, ze blijven echter gevoelig voor 4e generatie cephalosporines. Een aantal van de klinische plasmidaal AmpC-positieve isolaten bleken tevens resistent tegen carbapenem antibiotica.
Uit de karakterisatie van deze carbapenem resistente isolaten en uit de analyse van in vitro verkregen mutanten is gebleken dat het mechanisme verantwoordelijk voor de carbapenem resistentie berust op de verminderde doorlaatbaarheid van de buitenmembraan enerzijds en verhoogde produktie van plasmidaal AmpC beta-lactamase anderzijds. De verminderde doorlaatbaarheid van de buitenmembraan wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van insertie-elementen en frameshift mutaties in porine genen, waardoor de expressie van de porines wordt verhinderd. Deze verminderde permeabiliteit wordt gevolgd door verhoogde expressie van AmpC beta-lactamase doordat er mutaties in de regulatie-genen, betrokken bij de plasmide replicatie optreden, hierdoor worden er multipele kopien van het plasmide gemaakt en dit leidt weer tot verhoogde produktie van het AmpC beta-lactamase enzym.
Aangezien verminderde doorlaatbaarheid van de buitenmembraan een essentiele stap is in het ontstaan van carbapenem-resistentie is er een assay ontwikkeld, gebaseerd op de gevoeligheid voor EDTA en SDS, om op eenvoudige wijze de mate van permeabiliteit van de buitenmembraan te bepalen. Immers E. coli organismen met verminderde doorlaatbaarheid van de buitenmembraan en in bezit van plasmidaal AmpC beta-lactamase dienen niet langdurig behandelt te worden met carbapenem antibiotica om resistentievorming tijdens therapie te vóórkomen.

Met de reeds in 2012 verzamelde E. coli isolaten zullen we inzicht krijgen in de prevalentie van plasmidaal gecodeerde AmpC beta-lactamasen in van zowel een aantal Griekse als ook Nederlandse ziekenhuizen. Daarnaast krijgen we inzicht in de prevalentie van het aantal E. coli’s met verminderde permeabiliteit van het buitenmembraan. Behalve de prevalentie van bovengenoemde resistentie-mechanismen hebben we met name in het fundamentele deel van het onderzoek reeds informatie verkregen over de mate van het synergistisch effect van bovengenoemde mechanismen op het ontstaan van resistentie tegen carbapenem antibiotica.
Uit voorlopige resultaten blijkt dat de resistentie tegen carbapenem antibiotica plaats vindt in twee successievelijke stappen. In eerste instantie vermindert de permeabiliteit van het buitenmembraan van het organisme. Dit wordt later gevolgd door een toename van beta-lactamase activiteit, die echter niet leidt tot de afbraak van de antibiotica maar tot hun binding, waardoor ze hun antimicrobiële werking niet kunnen uitvoeren. Om deze vorm van resistentie in de toekomst te voorkomen, dienen de organismen in het bezit van verminderde doorlaatbaarheid van het buitenmembraan, beperkt bloot te worden gesteld aan antibiotica die kunnen selecteren tot verdere toename van beta-lactamase productie. Het is hierbij zaak organismen met verminderde permeabiliteit te herkennen. De groep van Prof. Tommassen is dan ook bezig een assay te ontwikkelen op basis van verminderde aminozuur opname waarmee onderscheid gemaakt kan worden tussen organismen met een normale- en verminderde permeabiliteit van het buitenmembraan. Deze organismen met verminderde permeabiliteit zullen in de toekomst worden opgespoord met deze eenvoudig uit te voeren assay. Na validatie van deze assay dient deze assay geïmplementeerd te worden in laboratoria belast met de diagnostiek van infectieziekten.

Samenvatting van de aanvraag

The current focus on organisms carrying ESBL and carbapenemase genes (e.g. KPC, NDM) has largely overshadowed the increasingly important and currently overlooked role of plasmid-encoded AmpC (pAmpC) beta-lactamases in facilitating carbapenem resistance in bacterial pathogens. The latter resistance mechanism is particularly relevant in Enterobacteriaceae that also possess deficiencies in their outer membranes, a process that is not clearly understood. The current narrow focus on ESBLs and carbapenemases has tended to (i) ignore the increasing worldwide prevalence of pAmpC carriage by bacterial pathogens, (ii) overlook the growing potential of pAmpC-carrying pathogens to become carbapenem resistant during therapy, and (iii) highlight our lack of knowledge regarding the prevalence and evolution of outer membrane deficiencies in bacterial pathogens, including their role in the development of antimicrobial resistances. In fact, the problems associated with pAmpC carriage are often understated, as the plasmid-borne ampC gene and corresponding phenotype is not always recognized. Consequently, the ampC-bearing plasmid can pass unnoticed between hospital and community environments and between bacteria. Additionally in several countries, pAmpC carriage has now been associated with the virulent Escherichia coli strain O25b/ST131, an organism that has been very successful in helping global spreading CTX-M-15-mediated antimicrobial resistance. Essentially, the prospect of bacterial isolates evolving that possess pAmpC is extremely alarming, as it greatly limits therapeutic antimicrobial options. Even within our own hospital, the rise in prevalence of pAmpC-carrying isolates has been remarkable. As just one example, from our own data collection at the Erasmus University Medical Center, Rotterdam (EMCR), the number of E. coli isolates possessing plasmid-encoded ampC resistance genes has greatly increased over the last 5 years (i.e. from 0% in 2006 to 9% in 2010 of the 3rd generation resistant E. coli’s), such that pAmpC carriage has now become clinically relevant. Further, in collaboration with Utrecht University, our work has also shown that carriage of pAmpC, coupled to the development of mutations affecting the bacterial outer membrane, results in increased MICs to carbapenems, thereby reducing even more the available treatment options for affected patients. Therefore, based on our recent experiences and unpreparedness for the drastic global spread of CTX-M-15-mediated antimicrobial resistance, it is essential that we develop preventative measures that will help predict, monitor and limit the further spread of pAmpC-mediated carbapenem resistance in both hospital and community settings. In this respect, this project is designed to investigate the molecular processes involved in the acquisition of pAmpC, and as well as the mechanisms facilitating the development of bacterial outer membrane deficiencies. By understanding the in vitro mechanisms involved in selection for carbapenem resistance we will be able to prevent/inhibit the mechanisms that lead to carbapenem resistance in bacterial pathogens carrying plasmid-encoded AmpC beta-lactamases. Essentially, the project will define the in vitro processes that facilitate carbapenem resistance in bacterial pathogens expressing plasmid-encoded AmpC beta-lactamases. This will be achieved by investigating the acquisition of pAmpC and the down-regulation of bacterial outer membrane porins, using E. coli as a model organism. Further, by exposing E. coli’s in vitro to different antibiotics in different concentration ranges, we will investigate the development of pAmpC-mediated carbapenem resistance. The development of resistance and corresponding resistance mechanisms will be defined using, a combination of gene expression, sequencing and membrane permeability techniques. The end results will be a clear understanding of the processes and mechanisms that lead to the development of pAmpC-mediated carbapenem resistance and the availability of phenotypic assays to evaluate isolates for decreased outer-membrane permeability.

Onderwerpen

Kenmerken

Projectnummer:
205200006
Looptijd: 100%
2012
2016
Gerelateerde subsidieronde:
Priority Medicines Antimicrobiële Resistentie uitwerking tweede ronde
Projectleider en penvoerder:
Dr. W.H.F. Goessens
Verantwoordelijke organisatie:
Erasmus MC