Carbapenem-resistance selection and characterization of Enterobacteriaceae carrying plasmid-encoded AmpC beta-lactamases
Projectomschrijving
Wereldwijd neemt de resistentie van Escherichia coli tegen 3e generatie cephalosporines ten gevolge van plasmidaal gecodeerde β-lactamase enzymen toe. De behandeling van infecties met dergelijke resistente organismen berust veelal op het toedienen van carbapenem antibiotica. Tijdens de behandeling kunnen echter mutanten ontstaan met een verminderde doorlaatbaarheid van de buitenmembraan waardoor organismen tijdens therapie resistent worden voor desbetreffend antibioticum.
Het doel van dit onderzoek is dan ook in vitro de processen te bestuderen die het ontstaan van carbapenem resistentie bevorderen. Hiervoor zullen E. coli organismen in vitro blootgesteld worden aan verschillende antibiotica, verschillende concentraties en gedurende verschillende tijdstippen om zo inzicht te krijgen welke omstandigheden tot carbapenem resistentie leiden. In deze experimenten zal tevens de expressie van relevante genen in combinatie met de permeabiliteit van de buitenmembraan bestudeerd worden.
Producten
Auteur: W. H. F. Goessens, A.K. van der Bij, R. van Boxtel, J.D.D. Pitout, P. van Ulsen, D.C. Melles and J. Tommassen
Magazine: Antimicrobial Agents and Chemotherapy
Auteur: S. Paltansing, M.E.M. Kraakman, H.A.M. van Boxtel, I. Kors, E. Wessels, W.H.F. Goessens, J.P. Tommassen and A. T. Bernards
Magazine: Microbial Drug Resistance
Verslagen
Eindverslag
Antibioticum resistentie is een wereldwijd probleem en we zien dan ook behalve een toename in het absolute aantal resistente micro-organismen ook een toename in de diversiteit van resistentie-mechanismen. Een mechanisme van resistentie dat in toenemende mate wordt aangetoond in E. coli bacterien, is de aanwezigheid van plasmidaal gecodeerde AmpC beta-lactamasen. Uit de in het project uitgevoerde prevalentiestudie blijkt dat in 0,1% van E. coli isolaten het mechanisme van plasmidaal AmpC voorkomt. Desbetreffende E. coli organismen zijn hierdoor resistent tegen alle penicillines en cephalosporines, ze blijven echter gevoelig voor 4e generatie cephalosporines. Een aantal van de klinische plasmidaal AmpC-positieve isolaten bleken tevens resistent tegen carbapenem antibiotica.
Uit de karakterisatie van deze carbapenem resistente isolaten en uit de analyse van in vitro verkregen mutanten is gebleken dat het mechanisme verantwoordelijk voor de carbapenem resistentie berust op de verminderde doorlaatbaarheid van de buitenmembraan enerzijds en verhoogde produktie van plasmidaal AmpC beta-lactamase anderzijds. De verminderde doorlaatbaarheid van de buitenmembraan wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van insertie-elementen en frameshift mutaties in porine genen, waardoor de expressie van de porines wordt verhinderd. Deze verminderde permeabiliteit wordt gevolgd door verhoogde expressie van AmpC beta-lactamase doordat er mutaties in de regulatie-genen, betrokken bij de plasmide replicatie optreden, hierdoor worden er multipele kopien van het plasmide gemaakt en dit leidt weer tot verhoogde produktie van het AmpC beta-lactamase enzym.
Aangezien verminderde doorlaatbaarheid van de buitenmembraan een essentiele stap is in het ontstaan van carbapenem-resistentie is er een assay ontwikkeld, gebaseerd op de gevoeligheid voor EDTA en SDS, om op eenvoudige wijze de mate van permeabiliteit van de buitenmembraan te bepalen. Immers E. coli organismen met verminderde doorlaatbaarheid van de buitenmembraan en in bezit van plasmidaal AmpC beta-lactamase dienen niet langdurig behandelt te worden met carbapenem antibiotica om resistentievorming tijdens therapie te vóórkomen.
Met de reeds in 2012 verzamelde E. coli isolaten zullen we inzicht krijgen in de prevalentie van plasmidaal gecodeerde AmpC beta-lactamasen in van zowel een aantal Griekse als ook Nederlandse ziekenhuizen. Daarnaast krijgen we inzicht in de prevalentie van het aantal E. coli’s met verminderde permeabiliteit van het buitenmembraan. Behalve de prevalentie van bovengenoemde resistentie-mechanismen hebben we met name in het fundamentele deel van het onderzoek reeds informatie verkregen over de mate van het synergistisch effect van bovengenoemde mechanismen op het ontstaan van resistentie tegen carbapenem antibiotica.
Uit voorlopige resultaten blijkt dat de resistentie tegen carbapenem antibiotica plaats vindt in twee successievelijke stappen. In eerste instantie vermindert de permeabiliteit van het buitenmembraan van het organisme. Dit wordt later gevolgd door een toename van beta-lactamase activiteit, die echter niet leidt tot de afbraak van de antibiotica maar tot hun binding, waardoor ze hun antimicrobiële werking niet kunnen uitvoeren. Om deze vorm van resistentie in de toekomst te voorkomen, dienen de organismen in het bezit van verminderde doorlaatbaarheid van het buitenmembraan, beperkt bloot te worden gesteld aan antibiotica die kunnen selecteren tot verdere toename van beta-lactamase productie. Het is hierbij zaak organismen met verminderde permeabiliteit te herkennen. De groep van Prof. Tommassen is dan ook bezig een assay te ontwikkelen op basis van verminderde aminozuur opname waarmee onderscheid gemaakt kan worden tussen organismen met een normale- en verminderde permeabiliteit van het buitenmembraan. Deze organismen met verminderde permeabiliteit zullen in de toekomst worden opgespoord met deze eenvoudig uit te voeren assay. Na validatie van deze assay dient deze assay geïmplementeerd te worden in laboratoria belast met de diagnostiek van infectieziekten.