A next generation mass spectrometry platform for rapid and accurate identification of (multi-)drug resistant Gram-negative bacteria

Projectomschrijving

Antibiotica resistentie van bacteriën is een toenemend probleem bij de behandeling van infectieziekten. Omdat de routine laboratoriumbepalingen tenminste twee dagen in beslag nemen, hebben wij met nieuwe technieken op basis van massaspectrometrie bacteriën onderzocht op antibiotica resistentie. De resistentie tegen beta-lactam antibiotica (penicillines, cefalosporines en carbapenems) bleek snel en betrouwbaar te kunnen worden aangetoond. Vervolgens is de techniek geoptimaliseerd om direct op patiëntmateriaal te gebruiken en werd in een prospectief onderzoek in twee grote academische ziekenhuizen deze techniek toegepast op 170 patiënten met positieve kweken van het bloed. De techniek werkte uitstekend met 95% betrouwbaarheid en was zelfs in staat een nieuwe vorm van resistentie tegen carabapenems te ontdekken. Tijdens de ontwikkeling van deze techniek werd ook vastgesteld dat een variant van deze techniek in staat was om een uitbraak van een multiresistente Pseudomonas aeruginosa te herkennen. We concluderen dat deze toepassing van massaspectrometrie zeer geschikt is om snel antibiotica resistentie aan te kunnen tonen.

Verslagen


Eindverslag

Derde en vierde generatie cefalosporines, carbapenems en aminoglycosiden zijn de meest voorgeschreven antibiotica in ziekenhuizen. Resistentie voor deze antibiotica is een groot en toenemend probleem, wereldwijd. Snelle en betrouwbare herkenning van antibiotica resistente bacteriën is belangrijk in de behandeling van patiënten en het tegengaan van het verspreiden van deze micro-organismen. Routine laboratoriumbepalingen nemen tenminste twee dagen in beslag en zijn traag. De introductie van “Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry” (MALDI-TOF MS) als platform voor identificatie van micro-organismen heeft enorme gevolgen gehad voor snelle diagnostiek in de medische microbiologie. Echter, als het aankomt op het vaststellen van antibiotica resistentie schiet deze techniek tekort. In dit project lag de focus op het ontwikkelen van nieuwe massaspectrometrische methodes die in staat zijn om antibiotica resistentie te herkennen. In de eerste fase van het project werd gebruik gemaakt van een nieuwe techniek om capillaire elektroforese direct te koppelen aan massaspectrometrie (CE-MS). Met deze techniek konden we uitstekend de meest voorkomende carbapenemases (OXA-48 en KPC) en extended-spectrum-beta-lactamases (ESBLs) in Gram-negatieve bacteriën detecteren. Het platform was niet geschikt om aminoglycoside resistentie op eiwit-niveau te herkennen omdat de intracellulaire concentraties van deze enzymen te laag was. In de tweede fase van het project werd het platform verder ontwikkeld om direct op patiëntmateriaal toe te kunnen passen. In een prospectieve setting zijn vervolgens in twee academische ziekenhuizen alle positieve bloedkweken onderzocht met LC-MS/MS (variant van CE-MS), moleculaire technieken en fenotypische technieken. Van de 170 bloedkweken waarvan 22 een ESBL-producerende bacterie bevatten, werd in 95% correct dit met de LC-MS/MS vastgesteld. Ook konden we met deze techniek een nieuwe vorm van carbapenem resistentie herkennen bij Achromobacter xyloseoxidans. Naast deze lijn hebben wij nog een variant platform opgezet en getest, de zogenaamde MALDI-Fourier transform ion cyclotron resonance (MALDI-FTICR). Deze vorm van massaspectrometrie heeft een ultrahoge resolutie en is ook in staat de verwantschap van bacteriën te bepalen. Met deze techniek konden we, beter dan met bestaande moleculaire technieken, een uitbraak van een multiresistente Pseudomonas aeruginosa herkennen. We concluderen dat nieuwe massaspectrometrische methodes uitstekend geschikt zijn om snel antibiotica resistentie tegen beta-lactamantibiotica aan te kunnen tonen. De potentiële tijdwinst en de identificatie van een actief biomolecuul zijn zeer belangrijke vernieuwingen en zullen in de routine van microbiologische laboratoria in de volgende generatie van massaspectrometrie moeten worden meegenomen.

De optimalisering van "Capillary-electrophoresis mass spectrometry"(CE-MS) voor de detectie van multi-resistente grammegative bacterien is in 2013 afgerond voor de detectie van cefalosporinasen en carbapenemasen. Vervolgens is de techniek gebruikt op een aantal bekende isolaten die volledig waren gekarakteriseerd met moleculaire methoden en met een nieuw ontwikkelde Maldi-TOF analyse op de afbraak producten van carbapenems. De CE-MS was beter in staat om de carbapenemases te detecteren dan de conventionel methoden en kon vooral de aanwezigheid van meerdere enzymen goed vaststsellen. Het nadeel was dat lage hoeveelheden van intrinsiek aanwezige cefalosporinasen moeilijker ging dan met de moleculaire detectie. De voorlopige conclusie is dat CE-MS vooral geschikt lijkt voor de detectie van carbapenem afbrekend enzymen.

Samenvatting van de aanvraag

Third and fourth generation cephalosporins, carbapenems and aminoglycosides are in hospitals the most widely administered classes of antibiotics. Resistance rates are increasing among several problematic pathogens which produce proteins that counteract antibiotics. There is clearly a ‘need for speed’ of diagnostics, as rapid and accurate identification of a drug resistant pathogen is of major importance for effective patient management. MALDI-ToF Mass spectrometry (MS) has brought a revolution in clinical microbial identification but is not optimal for the detection of subtle protein changes. Since bacterial antibiotic resistance can reside in the genome as a single gene insertion, we propose to use a highly sensitive mass spectrometric platform, Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry (CE-MS), capable of identifying single protein changes. Recently, a breakthrough in CE-MS analysis was accomplished by introducing a sheathless interface which is most favorable for coupling CE with nano-electrospray ionization mass spectrometry. This is optimal for the analysis of minute amounts of complex protein mixtures with high resolution and accuracy. In a pilot experiment, the applicability of this method was proven by identifying a beta-lactamase (TEM-1) enzyme in a single resistant Escherichia coli colony. Using the experiences of the Biomolecular Mass Spectrometry Unit and the Bacteriological research group of multidrug resistant Gram-negative bacteria at the LUMC together with the support of our national and European collaborators, our major goal is to develop and optimize CE-MS as a rapid and accurate diagnostic platform for recognition of multi-drug resistant Enterobacteriaceae. Our project has the following objectives: 1. To explore CE-MS as a potential technique for identification of multi-drug resistant traits in a single bacterial colony and optimization of the protocols. 2. To apply CE-MS on well defined (multi-)drug resistant isolates directed to clinically relevant beta-lactamases and aminoglycosides modifying enzymes. 3. To apply CE-MS in a comparative prospective study to identify (multi-) drug resistant Enterobacteriaceae. We expect that this novel method has the potential to be implemented in reference centers and microbiological laboratories in routine testing of Gram-negative multi-drug resistant isolates.

Onderwerpen

Kenmerken

Projectnummer:
205200005
Looptijd: 100%
2012
2018
Gerelateerde subsidieronde:
Priority Medicines Antimicrobiële Resistentie uitwerking tweede ronde
Projectleider en penvoerder:
Prof. dr. E.J. Kuijper
Verantwoordelijke organisatie:
Leiden University Medical Center