A next generation mass spectrometry platform for rapid and accurate identification of (multi-)drug resistant Gram-negative bacteria
Projectomschrijving
Verslagen
Eindverslag
Derde en vierde generatie cefalosporines, carbapenems en aminoglycosiden zijn de meest voorgeschreven antibiotica in ziekenhuizen. Resistentie voor deze antibiotica is een groot en toenemend probleem, wereldwijd. Snelle en betrouwbare herkenning van antibiotica resistente bacteriën is belangrijk in de behandeling van patiënten en het tegengaan van het verspreiden van deze micro-organismen. Routine laboratoriumbepalingen nemen tenminste twee dagen in beslag en zijn traag. De introductie van “Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry” (MALDI-TOF MS) als platform voor identificatie van micro-organismen heeft enorme gevolgen gehad voor snelle diagnostiek in de medische microbiologie. Echter, als het aankomt op het vaststellen van antibiotica resistentie schiet deze techniek tekort. In dit project lag de focus op het ontwikkelen van nieuwe massaspectrometrische methodes die in staat zijn om antibiotica resistentie te herkennen. In de eerste fase van het project werd gebruik gemaakt van een nieuwe techniek om capillaire elektroforese direct te koppelen aan massaspectrometrie (CE-MS). Met deze techniek konden we uitstekend de meest voorkomende carbapenemases (OXA-48 en KPC) en extended-spectrum-beta-lactamases (ESBLs) in Gram-negatieve bacteriën detecteren. Het platform was niet geschikt om aminoglycoside resistentie op eiwit-niveau te herkennen omdat de intracellulaire concentraties van deze enzymen te laag was. In de tweede fase van het project werd het platform verder ontwikkeld om direct op patiëntmateriaal toe te kunnen passen. In een prospectieve setting zijn vervolgens in twee academische ziekenhuizen alle positieve bloedkweken onderzocht met LC-MS/MS (variant van CE-MS), moleculaire technieken en fenotypische technieken. Van de 170 bloedkweken waarvan 22 een ESBL-producerende bacterie bevatten, werd in 95% correct dit met de LC-MS/MS vastgesteld. Ook konden we met deze techniek een nieuwe vorm van carbapenem resistentie herkennen bij Achromobacter xyloseoxidans. Naast deze lijn hebben wij nog een variant platform opgezet en getest, de zogenaamde MALDI-Fourier transform ion cyclotron resonance (MALDI-FTICR). Deze vorm van massaspectrometrie heeft een ultrahoge resolutie en is ook in staat de verwantschap van bacteriën te bepalen. Met deze techniek konden we, beter dan met bestaande moleculaire technieken, een uitbraak van een multiresistente Pseudomonas aeruginosa herkennen. We concluderen dat nieuwe massaspectrometrische methodes uitstekend geschikt zijn om snel antibiotica resistentie tegen beta-lactamantibiotica aan te kunnen tonen. De potentiële tijdwinst en de identificatie van een actief biomolecuul zijn zeer belangrijke vernieuwingen en zullen in de routine van microbiologische laboratoria in de volgende generatie van massaspectrometrie moeten worden meegenomen.
De optimalisering van "Capillary-electrophoresis mass spectrometry"(CE-MS) voor de detectie van multi-resistente grammegative bacterien is in 2013 afgerond voor de detectie van cefalosporinasen en carbapenemasen. Vervolgens is de techniek gebruikt op een aantal bekende isolaten die volledig waren gekarakteriseerd met moleculaire methoden en met een nieuw ontwikkelde Maldi-TOF analyse op de afbraak producten van carbapenems. De CE-MS was beter in staat om de carbapenemases te detecteren dan de conventionel methoden en kon vooral de aanwezigheid van meerdere enzymen goed vaststsellen. Het nadeel was dat lage hoeveelheden van intrinsiek aanwezige cefalosporinasen moeilijker ging dan met de moleculaire detectie. De voorlopige conclusie is dat CE-MS vooral geschikt lijkt voor de detectie van carbapenem afbrekend enzymen.