Verslagen

Voortgangsverslag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Dit Memorabel project richt zich op het onderzoeken of een meervoudige therapie waarvan de chemische stoffen zijn verpakt in zogeheten nanodeeltjes beter werkt dan de huidige mogelijkheden om enkel symptomatisch de ziekte van Alzheimer te behandelen. Deze eigenschappen zijn gericht op het complexe karakter van de ziekte waarbij meerdere ziekteprocessen synchroon verlopen. Daarnaast vindt de ziekte van Alzheimer voornamelijk plaats in de hersenen die moeilijk te bereiken zijn voor de meeste medicatie. Om hersenopname van medicijnen te bevorderen zijn afgelopen jaar water-oplosbare polymere en fluorescent gelabelde nanodeeltjes van ongeveer 20 nm in diameter ontwikkeld. Toxiciteitsstudies laten een hoge mate van biocompatibiliteit zien voor deze materialen, aangezien zelfs bij hoge concentraties hCMEC/D3 breincellen en HeLa kankercellen geen negatieve respons vertonen. Daarnaast is het invangen van kleurstofmoleculen (Nile Red) succesvol aangetoond, een belangrijke stap richting het invangen van medicijnen. Cel-studies met hCMEC/D3 cellen laten opname van verschillende typen fluorescent-gemarkeerde nanodeeltjes zien. Er worden momenteel high-throughput bloed-hersen barrière doorlaatbaarheidsstudies opgezet om te testen welke van de ontworpen nanodeeltjes mogelijk het meest efficiënt wordt opgenomen in de hersenen vanuit het bloed. De nanodeeltjes zullen vervolgens getest worden in een binnen dit project gekarakteriseerd muismodel voor de ziekte van Alzheimer. Dit zogeheten J20 model was al eerder ontwikkeld maar is afgelopen jaar volledig gekarakteriseerd voor een zeer breed scala aan cognitieve eigenschappen. Dit muismodel ontwikkelt kenmerken van de ziekte al vanaf een leeftijd van 3 tot 6 maanden met cognitieve stoornissen, amyloïde plaques en een geactiveerd hersenimmuunsysteem waarbij zogeheten gliale cellen die onderdeel uitmaken van het hersenimmuunsysteem geactiveerd raken in aanwezigheid van amyloïde plaques. Veelbelovend is dat deze eigenschappen direct overeenkomen met de observaties in menselijke hersenen die afkomstig zijn van Alzheimer patiënten. Om te leren welke medicijnen het best in aanmerking komen voor inkapseling in de nanodeeltjes om vervolgens in de hersenen opgenomen te worden is afgelopen jaar een groot aantal moleculen getest voor hun effectiviteit in het verminderen van Alzheimer kenmerkende oxidatieve stress, ontstekingsreacties, amyloïde plaque vorming en toxische amyloïde beta oligomeren. Combinaties van diverse enzymen, antioxidanten en oligomeer neutraliserende compounds zijn in vitro getest en geïdentificeerd voor hun efficiëntie ter vermindering van oxidatieve stress, celdood en afbraak van amyloïde plaques. Gedurende het komende jaar zullen de verkregen resultaten met elkaar worden gecombineerd: de verschillende geïdentificeerde potentiele medicijnen zullen met elkaar gecombineerd worden en ingekapseld in een nanodeeltje, dat vervolgens toegediend zal worden aan het J20 muizenmodel om te onderzoeken of deze muizen daadwerkelijk een vertraging of zelfs stopzetten van het ziekteproces vertonen.

Resultaten
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Een reeks aan enkele polymeer keten nanodeeltjes zijn ontworpen en gekarakteriseerd met behulp van transmissie elektronen microscopie (TEM), atoom kracht microscopie (AFM) en dynamische licht verstrooiing (DLS). De data verkregen uit deze studies laten zien dat nanodeeltjes reproduceerbaar en homogeen worden gevormd van 12 tot 20 nm grootte. Daarnaast is aangetoond dat ze water-oplosbaar zijn, een belangrijk aspect bij intraveneuze toediening, en dat ze fluorescent gelabeld kunnen worden. Met behulp van fluorescente labeling is het mogelijk om deze deeltjes te detecteren in celcultuur assays en dierenstudies. Cellen van de bloedhersen barrière (endotheelcellen), een HeLa kankercellijn alsook neuronale cellen vertonen geen toxiciteit in aanwezigheid van nanodeeltjes tot een concentratie van 200 ug/ml. Met behulp van fluorescente kleuring werd aangetoond dat de nanodeeltjes worden opgenomen door een confluent gevormde monolaag van hcMEC/d3 endotheel cellen welke de bloed-hersen barrière nabootsen. Encapsulatie assays lieten al zien dat een kleurstof, Nile Red, goed kan worden ingekapseld in de nanodeeltjes wat een belangrijke aanwijzing geeft voor het mogelijke succes van insluiting van therapeutische stoffen. Dit jaar zijn ook een aantal assays ontworpen waarmee oxidatieve stress in cellen in cultuur kan worden gemeten. Deze assays maken gebruik van fluorescentie read-outs (DCFH) en neuroblastoma SHSY5Y cellen alsook elektrofysiologische activiteitsmetingen van rat primaire corticale neuronen. Oxidatieve stress werd aangetoond als gevolg van behandeling met H2O2 en hypoxie in neuroblastoma SHSY5Y cellen met behulp van een DCFH fluorescentie assay en immunofluorescente kleuring. Daarnaast werd aangetoond dat oxidatieve stress in beide modellen effectief geneutraliseerd kan worden met behulp van de stof curcumine. Rat primaire corticale neuronen vertonen verlies van synchroon elektrofysiologisch activiteitspatroon in aanwezigheid van H2O2, een oxidatieve mediator. Na toevoegen van curcumine aan H2O2 behandelde neuronen wordt het activiteitspatroon weer synchroon. Preliminaire assays lieten al zien dat curcumine, een antioxidant en remmer van toxische oligomeer vorming, ook kan worden gebonden aan de ontworpen nanodeeltjes zodanig dat het zijn activiteit niet verliest. Andere stoffen die in in vitro assays lieten zien dat ze actief zijn tegen de diverse aspecten van het Alzheimer beeld zijn de enzymen insuline-degraderend enzym (IDE) en neprilysine welke de amyloïde plaques kunnen voorkomen en zelfs afbreken, curcumine en diverse afgeleide stoffen verkregen van de Universidad Nacional de San Luis (Argentinië) en University of Naples Federico II (Napels, Italië) zijn gesynthetiseerd en aangetoond zeer effectief te zijn in het voorkomen van amyloïde beta plaque vorming en oligomeer toxiciteit. De geïdentificeerde medicijnen zullen komend jaar worden verpakt in de nanodeeltjes en getest op hun effectiviteit in J20 muizen. Deze muizen zijn een model voor de ziekte van Alzheimer en zijn afgelopen volledig gekarakteriseerd en gevalideerd voor onze studies. Ze vertonen een robuust fenotype met geactiveerde microglia en amyloïde plaques. J20 muizen vertonen een verstoorde biologische klok en verhoogde dagelijkse activiteit vergeleken met controle muizen. Daarnaast scoren J20 muizen significant slechter, vanaf een leeftijd van 6 maanden, bij een novel object recognition gedragstest. Amyloïde plaques zijn zichtbaar vanaf een leeftijd van 6 maanden waarna dit aantal sterk vergroot naarmate de muizen ouder worden. Immunofluorescentie studie van de hersenen vertoond sterk geactiveerde microglia die zich dichtbij plaque afzettingen bevinden. Gedurende het komende jaar zullen we de ingekapselde multi-drug cocktail gaan testen op deze J20 muizen in een longitudinale studie en we zullen de gedrags-metingen en immunofluorescentie metingen gebruiken als read-out voor de activiteit van de toegediende medicijnen.

Samenvatting van de aanvraag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

This project explores the potential of multi-target treatment of AD to halt disease progression. We hypothesize that, to develop therapeutics that effectively halt AD, the multifactorial complex character of this disease should be acknowledged. Most current strategies to develop treatment focus on isolated targets, which present only part of the disease spectrum. As a result, only symptom-alleviating medication is available at the moment.

 

We selected four previously established early disease markers including neuroinflammation, oxidative stress, plaque deposition and Abeta oligomer toxicity. A currently clinically trialed drug, Atrosab (Baliopharm), has been selected against neuroinflammation and efficacy of this drug will be established. We will make use of the Abeta scavenger compound library developed by Crossbeta Biosciences and optimize and select a (combination of) suitable compounds from this library based on reduction of Abeta oligomer load. As the Abeta proteolytic cleavage apparatus seems hampered in the AD brain, currently known Abeta degrading enzymes will be compared for suitability as therapeutic intervention. A cell-based assay has already been developed within the consortium to assay for degrading activity of Abeta in various aggregation states by such enzymes. Last, a selection of anti-oxidant compounds will be assayed for anti-oxidant activity. The combined effect of the selected compounds is first validated using an in vitro approach to obtain insight into the mechanism of action and to evaluate for drug-drug interactions upon administration in combination.

 

We will develop well-defined biodegradable nanoparticles, which will be designed and functionalized to encapsulate the selected drugs, enabling them to cross the blood-brain-barrier, and upon passage, will dissociate and release the active compounds at the appropriate location. Blood-brain-barrier passage of the nanoparticles will be evaluated using a revolutionary blood-brain-barrier on a chip approach. Successful candidates will be subjected to further toxicology profiling, first using a human neuroblastoma cell line followed by detailed analysis of toxicity using primary neuronal cultures. The efficacy of the developed multi-target delivery system will ultimately be tested for their impact on disease progression by means of in vivo cognition assays using an AD mouse model at various ages, to obtain approximate insight into the efficacy of our proposed therapeutic approach at various stages of disease progress. Degradability of the encapsulating nanocarriers and localized release of the selected drugs are tested using tissue characterization. Our approach will be further optimized via an iterative process in collaboration with the chemical (nanocarrier development) and physical (drug target selection) research groups and the two drug development companies involved.

 

The project aims to develop a transdisciplinary approach of doing science by continuously involving an assembled expert panel in which the director of the Alzheimer Centre at the UMCB, a local neurologist at the MST, a neurologist/clinical pharmacologist specialized in neurodegenerative disorders and two pharmaceutical companies interested in drug development participate. The role of this advisory panel is to actively participate in decision milestones in the research process as proposed.

 

Collectively, this project proposes a potentially high-impact novel therapeutic multi-target strategy to tackle the complex character of AD in combination with the blood-brain-barrier permeability challenge. The project team is comprised of a strong combination of experts in each of the respective fields required to successfully complete this project.

 

Naar boven
Direct naar: InhoudDirect naar: NavigatieDirect naar: Onderkant website