Verslagen

Eindverslag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Enterokokken zijn Gram-positieve bacteriën die normaal voorkomen in de darm van mens en dier. Tot aan de jaren ’80 van de vorige eeuw kwamen infecties veroorzaakt door Enterococcus faecium slechts zelden voor. De laatste 20 jaar is E. faecium echter een belangrijke veroorzaker van ziekenhuisinfecties. Infecties met E. faecium zijn vaak moeilijk te behandelen omdat dit organisme vaak resistent is tegen veel zo niet alle beschikbare antibiotica. Uit een recent overzichtsartikel van de National Healthcare Safety Network in de Verenigde Staten blijkt dat enterokokken de derde belangrijkste veroorzakers zijn van ziekenhuis gerelateerde infecties en zelfs de tweede belangrijkste veroorzaker van lijn sepsis. Op dit moment wordt ongeveer 40% van alle enterokokken infecties veroorzaakt door E. faecium en 60% door E. faecalis terwijl de verhouding E. faecium/E. faecalis 20 jaar geleden nog 1/9 was. Deze gedeeltelijke vervanging van E. faecalis door E. faecium is met name relevant omdat resistentie tegen belangrijke klassen van antibiotica zoals ampicillines en glycopeptiden voornamelijk voorkomt in E. faecium en bijna afwezig is in E. faecalis. Dit betekent dat E. faecium in toenemende mate klinische problemen geeft in ziekenhuizen en dat er alternatieve behandel methodes nodig gewenst zijn. Eén van die alternatieven zou immunotherapie kunnen zijn in de vorm van actieve of passieve vaccinatie. Hiervoor is het belangrijk om geschikte vaccin kandidaten te identificeren die aanwezig zijn in alle, of in ieder geval de overgrote meerderheid van stammen die verantwoordelijk zijn voor klinische infecties. Uit moleculair epidemiologische studies is bekend dat de meerderheid van infecties en ziekenhuisuitbraken worden veroorzaakt door een polyklonale genetische subpopulatie van E. faecium die genotypisch en genomisch verschillend is van E. faecium stammen die normaal in de darm voorkomen. Eén van de kenmerken van deze subpopulatie is de aanwezigheid van het esp gen wat codeert voor het Enterococcal Surface Protein, Esp. Door de constructie van een esp mutant zijn we in staat gebleken om de rol van Esp in de pathogenese van E. faecium infecties te bestuderen. Naast Esp, werden nieuwe potentiële vaccin kandidaten geïdentificeerd, namelijk SgrA en EcbA, twee oppervalkte eiwitten betrokken bij binding aan componenten van de extracellulaire matrix, en pili. Tenslotte werd middels een combinatie van bioinformatica en moleculaire biologie een nieuw genencluster geïdentificeerd in E. faecium wat mogelijk betrokken is bij de opname van complexe suikers. Van de potentiële vaccin kandidaten is tot nu toe alleen onderzocht of antilichamen gericht tegen Esp opsonophagocytose en killing bevordert en of deze antilichamen beschermend zijn na passieve immunisatie en challenge in een bacteremie in muizen. Hieruit bleek dat, ondanks dat Esp een rol speelt in een model van urine weg en bloedbaan infecties in muizen en endocarditis in ratten, Esp geen opsonophagovytose en killing bevordert en dat Esp antilichamen niet beschermend in het bacteremie model. Dit suggereert dat Esp geen beschermend antigeen en dus geen geschikte vaccin kandidaat lijkt te zijn. Vervolg experimenten zullen moet uitwijzen in hoeverre SgrA en EcbA dit wel zijn.

Resultaten
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Uit functionele studies is gebleken dat SgrA aan nidogeen en de alpha en beta keten van fibrinogeen kan binden. Daarnaast bleek dat EcbA ook aan fibrionogeen, kan binden maar dan aan de gamma-keten, en aan collageen type V. Dit betekent dat er twee nieuwe fibrinogeen bindende eiwitten in E. faecium zijn geïdentificeerd. Het is tevens voor het eerst dat er een bacterieel eiwit is gevonden dat bindt aan nidogeen. Het feit dat een SgrA mutant, die afgelopen periode werd geconstrueerd, duidelijk minder in staat was om biofilms te vormen op plastics, suggereert dat SgrA een belangrijke rol speelt bij binding en biofilm vorming van E. faecium aan katheters en stents. Dit werk is ter publikatie aangeboden aan “Infection and Immunity”.

De meest enerverende bevinding het afgelopen jaar was de ontdekking van pili aan het oppervlak van E. faecium. Pili of fimbriae zijn draadachtige eiwit structuren op het oppervlakte van bacteriën die betrokken zijn bij aanhechting. Middels een combinatie van Bioinformatica en moleculaire biologie werden vier potentiele pili genencluster geïdentificeerd (PGC1-4) in de genoom sequentie van E. faecium DO (TX0016). Twee clusters (PGC1 en 3) werden nader gekarakteriseerd. Met behulp van peptide antisera gericht tegen de veronderstelde major pilin subeenheden van PGC1 en 3, respectievelijk PilA en PilB kon met behulp van immuno-transmissie elektronen microscopie (immuno-TEM) gelabelde pili worden aangetoond op het oppervlak van E. faecium stam E1165, waarbij PilA in 40% en PilB in 15% van de cellen aan het oppervlak tot expressie komt. Verder bleek m.b.v. immuno-TEM en Western blots dat pili expressie lager was bij 21°C dan bij 37°C, alsmede variabel gedurende de groeifase met hogere expressie in de vroege logfase. Daarnaast komen PilA pili alleen tot expressie wanneer de cellen op plaat en niet wanneer ze in vloeibare cultuur worden gegroeid. Dit onderzoek is gepubliceerd in “Microbiology” (zie ook bij ingediende producten). In vervolg onderzoek werden de andere genen van het PGC-1 verder gekarakteriseerd in stam E1165 en E1039. Hieruit bleek dat PilF deel uitmaakt van PilA pili en voorkomt op de tip, langs de pilus schacht en aan de basis van de pilus. Dit suggereert dat PilF betrokken is bij initiatie en terminatie van pilus biogenese. PilE wat gecodeert wordt door het pilE in PGC-1 lijkt niet geassocieert te zijn met PilA pili. Of dit eiwit een rol speelt bij pilus biogenese is op dit moment nog onbekend. Deze bevindingen worden op dit moment verwerkt in een manuscript. Helaas is het vanwege de tijd binnen dit ZONMW project niet mogelijk gebleken om te onderzoeken of deze pili, net als veel andere Gram-negatiev en Gram-positieve pili, beschermende antigenen zijn in experimentel vaccinatie studies in proefdieren. De ontdekking van pili en de mogelijke toepassing van pili als vaccin kandidaat hebben we wel beschermd middels patent PCT/NL2008/050535.

Het afgelopen jaar hebben we ook veel vorderingen genaakt met het onderzoek naar de beschermende capaciteiten van anti-Esp antlichamen. In een opsonophagocytise assay bleken Esp antlichamen niet opsoniserend te zijn wat betekent dat ze phagocytose en killing niet bevorderden. Daarnaast bleken Esp antlichamen niet beschermend te zijn in een experimentele bacteremie infectie in muizen. Omdat de geconstrueerde Esp mutant ook niet geattenueerd bleek te zijn in een kolonisatie model in muizen (gepubliceerd in BMC Microbiologie; zie ingediende producten), is besloten om actieve immunisatie experimenten om kolonisatie van E. faecium te beïnvloeden niet uit te voeren. Esp lijkt echter wel degelijk een rol te spelen in de pathogenese van E. faecium infecties. De Esp mutant was namelijk wel geattenueerd in een experimentele urineweg infectie in muizen en in een model van experimentel endocarditis in ratten . Dit werk is gedeeltelijk beschreven in een publicatie in “Journal of Infectious Diseases (zie ook bij ingediende producten) en wordt nog gedeeltelijk verwerkt in een publicatie.

In een poging om naast de hierboven beschreven potentiële virulentie factoren andere genen te identificeren die mogelijk verrijkt zijn in ziekenhuis stammen en die zouden kunnen dienen als target voor immunotherapie, werd met behulp van een gecombineerde bioinformatische en moleculair biologische benadering genen geïdentificeerd met een afwijkende dinucleotide frequentie. Met behulp van deze benadering werd een nieuw genomisch island geïdentificeerd wat op grond van DNA homologie mogelijk codeert voor een nieuw suiker opname systeem. Dit cluster van genen was sterk verrijkt in ziekenhuisisolaten wat kan betekenen dat deze isolaten alternatieve metabole routes heeft voor het verwerken van suikers en verwerven van energie waardoor ze mogelijk in staat zijn om andere niches te koloniseren. Deze bevinding is gepubliceerd in Applied and Environmental Microbiology (zie ook bij ingediende producten). De exacte functie van dit cluster zal verder onderzocht moeten worden.

Voortgangsverslag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Infecties met multiresistente enterokokken, in het bijzonder vancomycine-resistente Enterococcus faecium (VRE), nemen wereldwijd toe vooral bij ernstig zieke en immuun-gecompromitteerde patiënten. Omdat VRE resistent zijn tegen bijna alle beschikbare antibiotica en omdat er op korte termijn geen nieuwe antibiotica te verwachten zijn is behandeling van infecties met de huidig beschikbare antibiotica nu en in de nabije toekomst zeer moeilijk. Om deze reden zijn er nieuwe strategieën nodig om verspreiding van VRE te controleren en om infecties met deze bacterie te voorkomen. De meeste infecties en ziekenhuisuitbraken worden veroorzaakt door één E. faecium pandemische kloon, “Clonal Complex” 17 (CC17). CC17 wordt onder andere gekenmerkt door ampicilline en quinolone-resistentie en de aanwezigheid van een aantal specifieke oppervlakte eiwitten zoals het “Enterococcal Surface Protein” (Esp), en de oppervlakte eiwitten die worden gecodeerd door de genen, 2351, 2430, 903, 904 en 906. De rol van deze oppervlakte eiwitten in de pathogenese van E. faecium is nog niet duidelijk. Het doel van dit project is om te onderzoeken of er op basis van antilichamen gericht tegen Esp en de andere E. faecium CC17 oppervlakte eiwitten immunotherapie ontwikkeld kan worden. Belangrijk daarvoor is dat deze eiwitten tot expressie komen gedurende een natuurlijke infectie en dus een belangrijke rol spelen in de pathogenese van E. faecium CC17 infecties. Door het maken van isogene mutanten en het testen van deze mutanten in in vitro en in vivo modellen zal de rol van deze oppervlakte eiwitten in de pathogenese worden onderzocht. Daarnaast zullen vaccins en/of specifieke antilichamen op basis van deze oppervlakte eiwitten worden getest in experimentele infecties in proefdieren. Het ontwikkelen van vaccinatie strategieën als alternatief voor antibiotica is een nieuwe benadering om infecties met deze multiresistente bacteriën te voorkomen en te behandelen.

Resultaten
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Het afgelopen jaar hebben we ons voornamelijk geconcentreerd op functionele karakterisering van drie eerder ontdekte oppervlakte eiwitten, ORF 2351, 2430, en Esp en het verder ontwikkelen en opzetten van diermodellen om pathogenese en de beschermende effecten van antilichaam therapie en of vaccinatie te onderzoeken. Op grond van sequentie homologieën kon worden voorspeld dat ORF 2351 en ORF2430 zogenaamde extracellular matrix moleculen zouden kunnen binden. Na uitgebreide analyses o.a. via ELISA, Ligand affinity blots en surface plasmon resonance bleek ORF2351 specifiek te binden aan fibrinogeen en ORF2430 aan collageen type V. Beide ORFs werden hernoemd in Serine glutamaat repeat containing protein A (SgrA) (voormalig ORF2351) en E. faecium collagen binding protein A (EcbA) (voormalig ORF2430). Dit betekent dat, naast het eerder beschreven Acm, SgrA en EcbA twee nieuwe MSCRAMMs (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules) zijn, aanwezig in klinisch relevante E. faecium. In de literatuur zijn verschillende studies beschreven waaruit blijkt dat MSCRAMMs veelbelovende vaccin kandidaten zijn. We hebben daarom in eerste instantie onderzocht of SgrA en EcbA tot expressie komen tijdens infectie. Daartoe hebben we sera van 7 patiënten met een E. faecium bacteremie onderzocht op het voorkomen van SgrA en/of EcbA antistoffen. In één van de patiënten hebben we reactiviteit tegen deze eiwitten in serum kunnen aantonen wat betekent dat deze eiwitten in ieder geval immunogeen zijn en tot expressie kunnen komen tijdens infectie. Het feit dat we dit slechts tot nu toe in één patiënt hebben kunnen aantonen heeft zeer waarschijnlijk te maken met het feit dat deze sera vrij snel na het begin van de infectie werden afgenomen. Daarnaast werd er een SgrA mutant geconstrueerd in E. faecium stam E1162. Dit is een bloed isolaat behorende tot de pandemische en klinisch relevante CC17. Het maken van isogene mutanten in E. faecium is uitzonderlijk gecompliceerd. Op dit moment is er naast de SgrA mutant en de Esp mutant (zie onder) slechts één andere isogene mutant beschreven in E. faecium. Functionele karakterisering van de SgrA mutant vindt momenteel plaats.

Naast de SgrA mutant werd ook een Esp mutant geconstrueerd in E. faecium behorende tot CC17. Deze mutant vertoonde verminderde biofilm vorming en bevestigeden eerdere experimenten dat Esp betrokken is bij biofilm vorming. In vier van de zeven patiënten sera (zie boven) konden Esp antilichamen worden aangetoond wat bewijst dat ook Esp immunogeen is en tot expressie kan komen tijdens infectie. Het feit dat in meer patiënten Esp antilichamen dan SgrA of EcbA antilichamen konden worden aangetoond suggereert dat Esp eerder tijdens infectie tot expressie komt. De Esp mutant werd getest in twee diermodellen; een urineweg infectie model en een sepsis model. In beide modellen bleek de esp mutant duidelijk geattenueerd. Uit blaas en nier in het urineweg infectie model en uit de nieren in het sepsis model konden significant minder mutant dan wild type bacteriën worden geïsoleerd. Om te onderzoeken of Esp antilichamen muizen konden beschermen in het sepsis model werd aan muizen Esp antilichamen toegediend alvorens de muizen werden geïnfecteerd. In een eerst pilot experiment kon nog geen bescherming worden aangetoond. Deze experimenten zullen worden herhaald in het urineweg infectie model. Tenslotte, werd een E. faecium kolonisatie model opgezet. De bedoeling is om in dit model vaccinatie studies te gaan doen waarbij muizen eerst worden gevaccineerd met SgrA, EcbA of Esp waarna de muizen oraal worden geïnfecteerd met E. faecium. Het doel is om te onderzoeken of vaccinatie uiteindelijk kolonisatie met E. faecium CC17 kan beïnvloeden.

 

Samenvatting van de aanvraag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium (VREF) are important emerging antibiotic resistant pathogens, causing infections predominantly in severely ill and immunocompromised patients. VREF are resistant to almost all available antibiotics and its epidemiology in the recent decade represents the worst-case scenario of emergence of antibiotic resistance: From a nearly non-existing nosocomial pathogen in 1990 to a feared pathogen in 2000. As new classes of antibiotics are unlikely to be developed in the near future new modalities to control spread and prevent infections with multiple antibiotic-resistant microorganisms are needed.

VREF are present in different host populations, such as livestock, household animals, healthy European subjects and hospitalised patients worldwide. Molecular studies have identified a genetic lineage of VREF associated with hospital outbreaks and clinical infections in 3 continents (Europe, North-America and Australia). This so-called "epidemic" genetic lineage is characterised by ampicillin-resistance and a virulence factor, the enterococcal surface protein (Esp). Esp is part of a pathogenicity island (PAI), which probably contains more virulence factors. Although the exact role of Esp in the pathogenesis of E. faecium infections is not fully understood, it has been demonstrated that homologous of this polypeptide like Esp of E. faecalis, Rib and C-Alpha of Group B streptococci and R28 of group A streptococci are involved in virulence and are able to confer protective immunity. The aim of this project is to assess whether human immune globulins directed against cell wall proteins of VREF (like Esp and other virulence factors) can be used as prophylaxis to prevent infections and enteric colonization. In addition, cell wall proteins of VREF will be used to develop sub-unit vaccines to prevent infections and to develop recombinant live-vaccines to prevent colonization. The development of passive and active immunization strategies based on newly identified virulence factors offers unique possibilities for new preventive options to combat the emergence of multiple antibiotic-resistant pathogens.

 

Naar boven
Direct naar: InhoudDirect naar: NavigatieDirect naar: Onderkant website