Verslagen

Eindverslag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Dit eindverslag met projectnummer 120510006 heeft betrekking op de door Zonmw ingebouwde clausule waarbij in het eerste jaar een “proof of principle” Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) methode op celvrij foetaal DNA/RNA bereikt dient te worden (Zie bijlage Flow Chart Fase 1 en 2). Na verdere goedkeuring van Zonmw Preventiefonds kan een hernieuwde vervolgsubsidieaanvraag ingediend worden zonder vooraanmelding (zie uw brief dd. 30 mei 2007). Het Zonmw preventiefonds onderzoek is binnen het Maastricht Universitair Medisch Centrum+, locatie azM bekend onder de naam MAMOET. Dit Acroniem staat voor “MAternal blood Mlpa fOEtal DNA/RNA Test”. De algemene doelstelling van dit MAMOET project is om een robuuste, snelle, goedkope, betrouwbare, niet-invasieve prenatale diagnostische MLPA test te ontwikkelen om foetale numerieke chromosomale afwijkingen (aneuploïdie) vroeg in de zwangerschap te detecteren door gebruik te maken van celvrij foetaal DNA/RNA aanwezig in moederlijk bloedplasma.

In MAMOET fase 1: “MLPA proof of principle” en MAMOET fase 2: “een pilot studie op celvrij foetaal DNA/RNA bij bewezen trisomie 13, 18 of 21 foetussen” (Zie bijlage Flow Chart Fase 1 en 2), werd gebruikt om allereerst de MLPA methode te ontwikkelen op celvrij foetaal DNA en RNA. In een volgende stap werd nagegaan of met behulp van deze MLPA techniek DNA en RNA kwantificatie mogelijk is.

Zo hebben we met herhaaldelijk succes met behulp van de MLPA methode celvrij foetaal Y sequenties gedetecteerd dat non-invasief werd geëxtraheerd uit moederlijk bloedplasma afgenomen vroeg in de zwangerschap. Na preamplificatie van een 3-, 4-tal Y-loci en detectie met behulp van de bestaande MRC Holland P095 kit bevattende Y-MLPA probes wordt een mannelijke foetus opgespoord met hoge specificiteit en nog verder te bepalen sensitiviteit.De MLPA DNA ratiobepaling van 2:0 werd met succes uitgevoerd voor chromosoom 21 SNP loci. Met behulp van een aangepaste MLPA methode blijkt chromosoom 21 DNA SNP-haplotypering mogelijk. Dit geeft aan dat als de paternale SNP informatief is, een trisomie 21 detectie mogelijk wordt door een 2:1 of 1:0.5 ratio bepaling.

Verder toont onze werkwijze foetale CSH1 en CGB3 mRNA expressie aan in moederlijk bloedplasma. Om meer informatie met behulp van SNP’s te krijgen, werden meer chromosoom 21 genen zoals PLAC4, C21ORF105, COL6A1 en COL6A2, die allen in de throphoblast tot expressie komen, onderzocht.

Op basis van deze succesvolle resultaten verdient de verdere kwantificering van de chromosoom 21 MLPA methode op celvrij foetaal DNA/RNA verdere uitwerking.

Daarmee is aan de specifieke doelstellingen van Zonmw Preventiefonds jaar 1 voldaan.

Resultaten
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Huidige inzichten: Celvrij foetaal DNA/RNA is aanwezig in moederlijk bloed vanaf 4-6 weken zwangerschap, vanaf het moment dat de trophoblast/ placenta/ moederkoek gevormd wordt1, 2. Dit celvrij foetaal DNA/RNA loopt in het eerste trimester op tot ongeveer 6%. In de afgelopen 10 jaar is intensief gewerkt om foetaal DNA in moederlijk bloed te detecteren. Momenteel is het mogelijk via celvrij foetaal DNA diverse onderzoeken uit te voeren, zoals het vaststellen van het foetaal (mannelijk) geslacht (via Sanquin in Nederland diagnostisch mogelijk vanaf 8-9 weken zwangerschap), autosomaal dominante gendefecten van vaderlijke afkomst, rhesus D bloedgroepantagonisme en trisomie 21. Tot nu toe betrof het slechts pilot studies die met de nodige selectie bias gepaard gingen en waarbij complexe en kostbare methoden gebruikt werden. Tevens waren de resultaten slecht/niet reproduceerbaar (van Winden en Frints, 2009). Er is tot nu toe nog geen publicatie verschenen waarbij celvrij foetaal DNA/RNA met de MLPA methode werd gedetecteerd.

Nieuwe Inzichten (deze pilot studie): In MAMOET fase 1 werd zoals voorgesteld een aantal verdunningsreeksen ingezet waarbij foetaal DNA restmateriaal, afkomstig van bewezen 47, XY + 13 of +18 of +21 vruchtwater samples, samen met (g)DNA van een vrouwelijk 46,XX bloed sample werd ingemengd. We bereikten niet de gewenste 6% foetale component maar wel 15%-20% (data niet getoond). Met de agarose gel extractie methode van kleine/korte foetale DNA componenten bereikten we niet het gewenste resultaat en daarbij was het gebruikersonvriendelijk, foutgevoelig en niet geschikt voor de “high-through put” screening. Het leek ons het meest geschikt om een lineaire real-time PCR amplificatie stap uit te voeren voordat de MLPA detectie methode werd toegepast. Dit omdat in de literatuur beschreven verdubbelingen (duplicaties) of verlies (deleties) op deze manier betrouwbaar gedetecteerd kunnen worden.

In MAMOET fase 2 werd foetaal Y DNA in moederlijk bloedplasma succesvol en herhaaldelijk aangetoond op verschillende momenten in de zwangerschap tot aan 13+4/7 weken zwangerschap (Zie bijlage Figuur 1A en 1B).

Voor trisomie 21 detectie werd de preamplificatie methode op DNA/RNA aangepast en verder ontwikkeld op basis van de in de literatuur bekende genen die foetaal vroeg tot expressie komen. Omdat bij de trisomie 21 detectie niet zoals bij het Y chromosoom de aan- of afwezigheid gedetecteerd moet worden maar het aantal chromosomen 21 bepaald dient te worden, werkte de amplificatie methode niet dusdanig dat een trisomie 21 gedetecteerd kon worden met de klassieke P095 MLPA probe kit. Om een kwantificatie mogelijk te maken werd in de MLPA probe ontwikkeling gebruik gemaakt van single nucleotide variaties (SNPs). Zo werd in eerste instantie voor een viertal chromosoom 21 genen (Placenta Specific Transcript 4 (PLAC4), C21 open reading frame 105 (C21ORF105), Collageen type 6 alpha1 (COL6A1) en Collageen type 6 alpha 2 (COL6A2) met bekende coderende SNPs MLPA probes ontwikkeld (Zie bijlage Tabel 2 voor de sequenties) in samenwerking met MRC-Holland en Pathofinder. Deze probes werden uitgetest op controle (g)DNA samples waarbij het haplotype bepaald werd door sequentie methode. Het gewenste MLPA haplotype kon voor alle MLPA probes worden bepaald en gekwantificeerd waarbij een ratio van 1:0.5 bereikt werd (Zie bijlage Figuur 2). Op basis van de bekende fragment grootte van de SNP-allel-specifieke MLPA probe, is te voorspellen of het sample heterozygoot dan wel homozygoot is voor de SNP in kwestie. Hierdoor geeft de aanwezigheid of afwezigheid van een allel ratio van 1:1 als het genotype bijvoorbeeld AG of GA is, en een allel ratio van 2:0 als het genotype bijvoorbeeld AA of GG is. Bij een trisomie 21 sample is de allel ratio afhankelijk van de herkomst van het ouderlijke allel en geeft dus een 2:1 (= 1:0.5) ratio als het genotype AAG of GGA is.

Na de detectie van trisomie 21 op uitverdunde DNA samples werd de volgende stap gezet om na te gaan of deze probes ook op RNA/ cDNA bruikbaar zijn. Daarvoor moesten we eerst aantonen dat we bij onze extractie procedure zowel foetaal DNA als RNA isoleren door een aantal Y-loci te testen en trophoblast/placenta specifieke gen expressies te onderzoeken. Dit betrof de volgende genen: Chorionic Somatomammotropin Hormone 1 (CSH1)/ placental lactogen en Chorionic Gonadothropin, Beta polypeptide 3 (CGB3) (Zie bijlage Figuur 3A). Deze worden niet gevonden bij bloedmonsters van niet-zwangere vrouwelijke controles (Zie bijlage Figuur 3B). Vervolgens werd de MLPA probes voor chromosoom 21 PLAC4 uitgetest op placenta controle DNA/RNA en een tweetal vruchtwater DNA/RNA monsters (= alleen foetaal materiaal) waaruit blijkt dat de PLAC4 MLPA probe zowel op DNA als op RNA werkt (Zie bijlage Figuur 4A en 4B). verdere kwantificering en validatie van deze MLPA techniek met behulp van celvrij foetaal DNA en RNA is nodig en verdient verdere uitwerking.

Samenvatting van de aanvraag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Prenatal diagnosis includes invasive techniques (chorionic villus sampling or amniocentesis), which are used to detect chromosomal abnormalities in pregnancy. The major disadvantage of this technique is the procedure-related risk of abortion. Currently, no safe, non-invasive prenatal diagnostic tool exists to detect foetal chromosomal abnormalities. It is therefore challenging to develop a new non-invasive diagnostic prenatal test. Optimal test characteristics should include high efficiency, high reliability and low costs. Our goal is to develop such a prenatal diagnostic test on cell-free foetal DNA present in maternal plasma, using the innovative “Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification” (MLPA) technique, to detect trisomy 13, 18 and 21 in early pregnancy. The MLPA technique is highly specific, fast, cheap and applicable for high through put analysis. The Department of Clinical Genetics of the University Hospital Maastricht has a unique position in the Netherlands because we have large experience with single cell analysis for the purpose of pre-implantation genetic diagnosis (PGD), and we are thus used to work with very small amounts of DNA. After optimising the MLPA method on cell-free foetal DNA, we aim to test this new technique in prenatal practice. Therefore, pregnant women in the South-East region of The Netherlands who undergo prenatal screening are invited to collaborate in this study. We will compare the results of MLPA on cell-free foetal DNA present in maternal plasma with the MLPA results of invasively obtained foetal DNA, with conventional karyotyping; the “Gold Standard” and with clinical follow-up results of newborns. When validated, the MLPA test on cell-free foetal DNA can be rapidly implemented using the excellent dynamic management resources available through the “RIVM” in The Netherlands. If successful, this would mean an innovative break-through in the international field of prenatal diagnosis.

Naar boven
Direct naar: InhoudDirect naar: NavigatieDirect naar: Onderkant website