Verslagen

Eindverslag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Een multiplex PCR werd ontwikkeld om niet-invasief het foetale geslacht aan te tonen in maternaal plasma. Het voordeel van deze test is dat één Y-chromosoom specifieke merker (AMELY) gecombineerd wordt met 2 placenta-specifieke RNA merkers (CSH en CGB). Indien geen Y chromosoom gedetecteerd wordt, bieden de RNA merkers informatie of de test geslaagd is en of voldoende foetaal DNA en RNA aanwezig zijn in het sample om een betrouwbaar resultaat te hebben. Er is geen extra test nodig om dit aan te tonen als de foetus een meisje is, wat betekent dat binnen 2 tot 3 werkdagen een foetaal geslacht meegedeeld kan worden aan de zwangere in alle gevallen. De eerste validatie studie bij 75 zwangere vrouwen van 9+4 weken tot 34+1 weken zwangerschap toonde een 100% sensitiviteit en specificiteit aan in de verschillende fasen vande zwangerschap.

 

Met het bedrijf Pathofinder B.V. is de 2SMART test ontwikkeld voor het vroeg- en gelijktijdig opsporen van een aantal TORCH infecties in het bloed van zwangeren. Deze multiplex test detecteert: Treponema pallidum (lues-syfilis), Cytomegalovirus (CMV), Toxoplasma gondii, Rubella virus, Herpes Simplex Virus (HSV) 1 en 2, Varicella Zoster Virus (VZV) en Parvovirus B19 (PVB19). De test werkt technisch goed in plasma, serum en blaasjesvocht. De klinische validatiestudie in een cohort van 194 eerste trimester zwangerschappen met een a priori laag risico op TORCH infecties, liet zien dat de 2SMART test TORCH infecties betrouwbaar, snel en vroeg in de zwangerschap detecteert.

 

Resultaten
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Niet-invasieve geslachtsbepaling

Er werd een multiplex PCR ontwikkeld, die beter presteert dan de nu bekende methodes. Het voordeel zit er met name in dat onze geslachtsdetectietest 1 chromosoom-Y specifieke merker (AMELY) combineert met 2 verschillende foetale RNAs (CSH en CGB). Hierdoor kan bij afwezigheid van Y-chromosoom sequentie in de test bekeken worden of er voldoende foetaal DNA en RNA aanwezig was om de test betrouwbaar uit te voeren, of dat dit niet zo was en dus nieuw bloed geprikt zal moeten worden. Daardoor dient geen tweede test uitgevoerd te worden in het geval van een meisje. Er kan in alle gevallen met zekerheid binnen twee (eventueel drie) werkdagen een foetaal geslacht gemeld worden, wat een groot voordeel is voor de zwangeren. De test is geoptimaliseerd voor gebruik op kleine hoeveelheden plasma en toegepast in een geblindeerde set van 75 validatie plasma-samples. Het gaat hierbij om een validatie van de test in zwangerschappen van verschillende zwangerschapsduur (9-34 weken), waarbij met name de werking van de test in vroege zwangerschappen (9-14 weken) onderzocht werd. Dit laatste omdat bekend is dat de hoeveelheid foetaal DNA toeneemt met de zwangerschapsduur en deze test onder andere klinisch van belang is in zwangerschappen tussen 8 en 10 weken. De test is in duplo uitgevoerd en het geslacht is in 100% van de gevallen correct bepaald vanaf 9+4 weken zwangerschap. De NIPT-Y test bleek qua concentraties aangepast te moeten worden voor betrouwbare detectie van het geslacht tussen 8 en 10 weken zwangerschap, maar na deze aanpassing werkt de test feilloos voor vroege zwangerschappen. De resultaten van deze validatie studie worden momenteel opgeschreven en naar verwachting binnen een maand aangeboden ter publicatie. Deze resultaten vormen de basis voor discussies binnen de genoomdiagnostiek van onze afdeling voor aanbieding van deze test in de routine diagnostiek. Ook met Sanquin zal deze discussie gevoerd worden.

 

Niet-invasieve detectie van foetale infecties

In samenwerking met de firma PathoFinder B.V. is een moleculaire 2SMART multiplex test voor TORCH infecties (Treponema pallidum (lues, syfilis), Cytomegalovirus (CMV), Toxoplasma gondii, Parvovirus B19, Rubella virus, Varicella Zoster Virus ((VZV) = Humaan Herpes Virus type 3 (HHV3)), Herpes Simplex virus type 1 en 2 (HSV1/2))) ontwikkeld om deze vroeg- en gelijktijdig te detecteren in de zwangerschap. Bij de technische validatie werd de 2SMART getest op 56 positieve en negatieve monsters (serum, plasma en blaasjesvocht) van niet-zwangeren. De interne controle (IC), ingebouwd als kwaliteitscontrole voor het extractie- en het amplificatieproces, werd in alle monsters gedetecteerd.

De monsters waren eerder getest op TORCH, met moleculaire diagnostiek (n=45), en/of met ELISA (n=19). Er werden geen vals-positieven gevonden. Treponema pallidum DNA werd in 1 serummonster gedetecteerd. Er waren 3 serologisch positieve monsters bij een klinisch actieve lues infectie. De 2SMART moet voor lues diagnostiek verder getest worden. CMV werd in 12 van de 13 plasma- of serummonsters juist vastgesteld. De detectie-ondergrens van de 2SMART voor CMV werd in plasma vastgesteld op 200 CMV genoomkopieën per ml. CMV werd in 1 monster met 528 CMV genoomkopieën per ml. niet gedetecteerd. VZV werd 3 keer gedetecteerd. In 2 monsters werd VZV met de standaard moleculaire techniek gedetecteerd. In één geval werd geen VZV aangevraagd, terwijl VZV opgepikt werd met de 2SMART.

HSV2 werd 2 van de 2 keer in blaasjesvocht juist aangetoond.

Bij de klinische validatie studie, verricht op 194 plasmamonsters verzameld in het eerste trimester van de zwangerschap, was de test 192 keer negatief en 2 keer positief. In 165/194 monsters werden de uitslagen van 2SMART vergeleken met TORCH serologie. Er waren geen vals positieve 2SMART uitslagen. De 2SMART laat 2 terecht positieve uitslagen zien: 1 voor CMV en 1 voor Parvovirus B19. Beide bevindingen werden bevestigd met een gevalideerde real-time PCR.

De klinische validatiestudie illustreert dat de 2SMART vroeg in de zwangerschap meerdere TORCH infecties gelijktijdig en betrouwbaar kan opsporen.

 

Voortgangsverslag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

In het Maastricht Universitair Medisch Centrum+ wordt doorgewerkt aan het opzetten van een eenvoudige, betrouwbare, snelle, goedkope en veilige niet-invasieve prenatale test (NIPT) in moederlijk bloed. Deze test kan foetale chromosomale afwijkingen zoals trisomie 21 (T21: Downsyndroom), trisomie 18 (T18: Edwardssyndroom), en trisomie 13 (T13: Patausyndroom) opsporen. Op dit moment wordt nagegaan hoe betrouwbaar de nieuwe test is in een hoog-risicogroep zwangerschappen waarbij verschillende moleculaire sequentie methodes met elkaar vergeleken worden. Het onderzoeksteam heeft een handige manier gevonden om foetaal Y-DNA/RNA, dat vrij circuleert in moederlijk bloed rond 10-14 weken, op te sporen in moederlijk bloed (Mersy e.a., in preparatie). Daarmee kunnen we vroeg in de zwangerschap nagaan of het een jongen betreft in geval van een geslachtsgebonden erfelijke aandoening. Na een evaluatie van de kwaliteit van de verschillende NIPT methodes en studies (Mersy e.a., 2013), werd in 2013 een NIPT macrodatabank gebouwd en gevuld met klinische gegevens en laboratorium gegevens van NIPT zwangerschappen. Zo kan in 2014, als alle resultaten binnenkomen, gemakkelijk geanalyseerd worden. Verder worden de beslissingen die een zwangere kan nemen ten aanzien van het wel of niet screenen of testen op foetale trisomie 21 in kaart gebracht (Mersy e.a., in preparatie) en werden de ethische aspecten rond NIPT in een proefschrift verwerkt (de Jong, 2013). In samenwerking met het bedrijf Ariosa kijken we of de op MLPA-gebaseerde NIPT T21-T18-T13 betrouwbaar werkt in zwangerschappen met a priori hoog of laag risico (de NEXT studie).

Met het bedrijf Pathofinder wordt met behulp van de SmartFinderTM technologie, een op MLPA- gebaseerde zeer gevoelige snelle detectiemethode, gewerkt aan de verdere ontwikkeling van een multiplex test voor het tegelijk opsporen van foetale TORCH infecties zoals lues (syfilis), hepatitis B, HIV, rubella, cytomegalie en toxoplasmose. In een en hetzelfde experiment worden meerdere genomische regio’s en virus DNA/RNA’s van interesse tegelijk onderzocht. Dit kan een snelle, goedkope en efficiëntere manier worden om TORCH infecties vroeg in de zwangerschap te detecteren. De door TORCH infecties veroorzaakte aangeboren afwijkingen, intra-uteriene groeiretardatie en vruchtdood kunnen zo vroeger adequaat behandeld worden.

 

Resultaten
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Het includeren van hoog-risico zwangerschappen van de door de medisch ethische commissie (METC) goedgekeurde MAMOET-studie: “Maternal Blood MLPA Foetal DNA/RNA Test” gericht op foetale trisomie 21,18 en 13 detectie, wordt per 1 december 2013 gestopt. Door de snelle wereldwijde ontwikkelingen op het gebied van NIPT voor foetale trisomie 21,18 en 13 (T21-T18-T13) en omdat NIPT in de Nederlandse grensstreek in België (Antwerpen en Brussel), Duitsland (Aken) en in Engeland (Londen) zeer actief commercieel wordt aangeboden, zijn sinds mei 2013 het aantal invasieve vlokkentesten en vruchtwaterpuncties bij de afdeling prenatale diagnostiek dramatisch teruggelopen. Als gevolg hiervan zien wij ook een sterke afname van het aantal MAMOET studie inclusies in Zuid-Oost Nederland. Daarom heeft de projectgroep besloten om de MAMOET studie inclusie-fase te stoppen. Daarmee is het beoogde aantal inclusies niet behaald. Op dit moment zijn er in studie fase 2, 86 zwangerschappen geïncludeerd. In studiegroep 2a werden 23 van de beoogde 40 zwangerschappen geïncludeerd die een eerste trimester combinatie test ondergingen en een a priori laag risico hebben op foetale T21-T18-T13. Bloedmonsters uit studiegroep 2a worden vergeleken met de 63 bloedmonsters uit groep 2b die bestaat uit bewezen foetale T21-T18-T13 zwangerschappen. In studie fase 3 konden helaas maar 39 van de 750 vrouwen geïncludeerd worden die a priori hoog risico hadden van meer dan 1 op 50 (>1:50). Dit betrof zwangerschappen boven de leeftijd van 42 jaar of een uitslag van de combinatietest met een risico op T21-T18-T13 van >1:50 of echoafwijkingen, veelal rond 20 weken zwangerschap, die sterk verdacht waren voor T21-T18-T13. De in totaal 125 verzamelde bloedmonsters zullen, nadat de door Ariosa ontwikkelde op MLPA-gebaseerde T21-T18-T13 NIPT (Harmony test) kit aan Nederland vermarkt is, uitgetest worden in ons laboratorium via het HiSeq Illumina sequencing platform. De resultaten die we in ons laboratorium krijgen, zullen vergeleken worden met de NEXT studie resultaten die in maart 2014 verwacht worden. In de NEXT studie wordt de op MLPA-gebaseerde T21-T18-T13 moleculaire NIPT bij gemengd risico zwangerschappen door Ariosa zelf in de USA uitgevoerd. De testresultaten worden verwerkt tot gezamenlijke publicatie in 2014. Om de analyse van alle studieresultaten te vergemakkelijken werd in 2013 flink geïnvesteerd in het bouwen en in gebruik nemen van een veilige gecodeerde NIPT macrodatabank. De databank is gevuld met zowel klinische als laboratorium gegevens van de lopende NIPT studies.

Na METC goedkeuring van de “ReproductionFinder” (www.pathofinder.com) test ontwikkeling, werd per november 2013 gestart met het includeren van TORCH positieve bloedmonsters. Deze proof of principle pilot studie is gericht op het detecteren van foetale TORCH infecties in de zwangerschap en is gebaseerd op de MLPA-gebaseerde SmartFinderTM technologie. In de nu lopende experimenten wordt met behulp van positieve controle bloedmonsters TORCH infecties in multiplex uitgetest.

Tot slot, het onderzoeksteam zal zich in samenwerking met het Nederlandse NIPT Consortium het komende jaar weer inspannen om zo doelmatig mogelijk moleculaire NIPT voor foetale T21-T18-T13 te detecteren en valideren. Ook voor TORCH infecties in de zwangerschap zal zo “smart” en zo efficiënt mogelijk aan testontwikkeling worden gewerkt. Verder hopen we dat de NIPT wet bevolkingsonderzoek (WBO) aanvraag zal worden goedgekeurd om per 2014 in Nederland een multi-centra NIPT T21-T18-T13 proefimplementatiestudie te kunnen uitvoeren waar ook de psychologische en ethische aspecten verder aan bod komen. De hoog-risico lopende zwangere vrouwen hoeven dan ook niet meer uit te wijken naar het buitenland zoals nu het geval is.

 

Samenvatting van de aanvraag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Approximately, 10-20% of pregnancies end in miscarriage. The major causes of death are chromosomal abnormalities or first/second trimester infections. Despite nature’s selection, 3-5% of the newborns have congenital malformations. These include 0.5-1% chromosomal abnormalities (0.3% being trisomy 21), and 1-4% fetal/intrauterine infections. Chromosomal abnormalities and/or infections can be diagnosed through chorionic villus sampling (CVS) or mainly through amniocentesis (AC). However, the procedure-related risk of abortion is between 0.5-1% for AC and up to 2% for CVS. Currently, no safe, reliable, cost-effective, non-invasive prenatal diagnostic test exists to detect e.g. trisomy 21. It is therefore challenging to develop such a non-invasive prenatal diagnostic test.

The main indications for invasive prenatal investigation are ultrasound abnormalities, high maternal age or increased risk for trisomy 21 on the basis of first trimester screening (using the combination test). The number of false-positive test results after prenatal diagnosis based on prenatal screening risk calculations is still high, although lower than for maternal age as a “screening instrument” only. So, still too much invasive procedures are done unnecessary and may lead to unwanted abortion due to the invasive procedure. Our general aim is to develop a reliable non-invasive prenatal diagnostic test on cell-free fetal DNA/RNA present in maternal plasma, using the “Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification” (MLPA) technique. To achieve this goal we will use cell-free fetal DNA/RNA which circulates in maternal blood from 5-6 weeks pregnancy. During pregnancy the amount of cell-free fetal DNA/RNA is gradually increasing which makes it detectable through PCR-based techniques from more or less 8-9 weeks of pregnancy. Because the MLPA technique allows precise quantification, it is a good candidate method to detect highly fragmented small amounts of cell-free fetal DNA/RNA within maternal plasma. The MLPA-test provides rapid detection and the combination of probes makes it possible to detect multiple genomic regions at once. Different MLPA-kits (www.mrc-holland.com) are already on the market to detect the most frequent chromosomal abnormalities and (lung) infections (www.pathofinder.nl). The non-invasive prenatal MLPA test we develop further contains MLPA probes to detect the most common trisomies 13, 18 and 21. In parallel with this non-invasive MLPA analysis we try to develop a combined non-invasive prenatal MLPA test that also detects the most important intrauterine/fetal and perinatal TORCH infections (Toxoplasmosis, Other infections such as syphilis, hepatitis B, varicella-zoster virus, human immunodeficiency virus, parvovirus B19, Rubella, Cytomegalovirus and Herpes simplex virus) at the same time in pregnancy. This “TORCH infections” part needs further proof of principle and will be developed in close collaboration with the Pathofinder Company research-team.

The specificity, sensitivity and reproducibility of the non-invasive MLPA test will be determined and compared with existing methods of prenatal diagnosis, first/ second trimester screening and with biochemical and/or molecular investigations such as quantitative real-time fluorescent PCR, targeted sequencing and TORCH-serology.

The current study and MLPA method is (already) approved by the local medical ethical committee and is divided in three phases.

Faze 1, consists of continuation of the MLPA proof of principle for chromosomes 13, 18 and for development of MLPA-probes to detect prenatal TORCH infections. Surplus maternal and cell-free fetal DNA/RNA will be used for this development. In Faze 2, a pilot study will be performed in 40 pregnant women with a low risk for fetal trisomy 21. They will be recruited at the time of first trimester screening (group 2a). Maternal blood EDTA samples from group 2a are compared with samples from group 2b consisting of 10 proven fetal trisomy 21, five trisomy 18 and two trisomy 13 pregnancies. In Faze 3, 715 women will be included from a high risk group (age ≥ 36 years, risk for trisomy 21 ≥ 1:250 after prenatal screening or ultrasound abnormalities pointing to a chromosomal abnormality). After informed consent from the pregnant woman and her partner, 2x20 ml EDTA blood will be (repeatedly) taken. Maternal and cell-free fetal DNA/RNA will be isolated in duplicate following standard procedure (QIAamp MinElute Virus kit from Qiagen). Samples are immediately used for MLPA detection after specific amplification in one tube-experiment. Results obtained in faze III with the non-invasive MLPA test will be compared at the end of the study with the results obtained from invasive prenatal testing or pregnancy outcome. Efficiency, validity (sensitivity and specificity), reliability (reproducibility) and actual costs to further implement this non-invasive MLPA test into a multi-centre prospective cohort study will be determined.

Naar boven
Direct naar: InhoudDirect naar: NavigatieDirect naar: Onderkant website