Verslagen

Eindverslag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Staphylococcus aureus (S. aureus) is een gevreesde bacterie die in de mens verschillende, vaak levensbedreigende infecties kan veroorzaken. Een groot probleem is dat steeds meer S. aureus stammen resistent worden tegen de bestaande antibiotica. Antibiotica met een nieuw werkingsmechanisme zouden uitkomst kunnen bieden om de resistentie tegen te gaan. Dit project richtte zich op het gebruiken van een een enzym (sortase) dat de bacterie zelf gebruikt voor de verankering van eiwitten in het oppervlak, voor antimicrobiele doeleinden. Deze eiwitten spelen een belangrijke rol in de virulentie van de bacterie, omdat die nodig zijn voor hechting van de bacterie aan cellen en weefsels van de gastheer. Doel van dit project was om te onderzoeken of het mogelijk is synthetische verbindingen in te bouwen in de celwand van S. aureus, gebruikmakend van het eigen sortase. We hebben met succes een aantal stoffen ontwikkeld die met hoge efficiëntie door de bacterie worden ingebouwd in de celwand met zijn eigen sortase. Hiermee hebben we een transportmiddel verkregen waarmee doelgericht anti-microbiele middelen kunnen worden ingebouwd in de celwand van S. aureus om zo infecties te bestrijden. Dit biedt de mogelijkheid tot ontwikkeling van een nieuwe generatie antimicrobiele middelen met een geheel nieuw werkingsmechanisme.

Resultaten
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Een set moleculen (pseudo-substraten) is ontwikkeld die het sortase herkenningsmotief bevatten. Deze substraten werden tijdens de groei door sortase in de celwand van S. aureus ingebouwd. Pseudo-substraat gekoppeld aan reeds bestaande antimicrobiele verbindingen werden ook in de celwand ingebouwd. Dit resulteerde echter niet in een meetbare toename in bacterie-dodende activiteit, waarschijnlijk veroorzaakt door de relatief lage inbouw efficiëntie. Er is daarom onderzocht naar manieren om de inbouw te verbeteren. De volgende drie benaderingen zijn gekozen:

(i) het optimaliseren van het oorspronkelijke herkenningsmotief op basis van literatuurgegevens (LPETG --> LPMTG). De substitutie van E door M resulteerde in een verdubbeling van de inbouw.

(ii) In vivo speelt de sortase reactie zich af in de nabijheid van bacteriemembraan. Het geoptimaliseerde substraat is gekoppeld aan een membraan-zoekende domein dat aanwezig is in een natuurlijk sortase substraat.

(iii) Koppeling aan vancomycine, een molecuul met hoge affiniteit voor bacteriele membranen.

Zowel (ii) als (iii) resulteerde in een verhoging van de inbouw efficiëntie. Met name koppeling aan vancomycine resulteerde in een 100 tot 1000-keer efficiëntere inbouw. Vancomycine-LPMTG lijkt daarmee een veelbelovende instrument om de celwand van S. aureus te modificeren voor antimicrobiële toepassing.

 

Samenvatting van de aanvraag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Sortases are membrane-associated enzymes, which are involved in the cell wall synthesis of Gram-positive bacteria, including Staphylococcus aureus. Sortase A is the key enzyme which covalently tethers proteins via the sortase recognition motif LPETG, to the peptidoglycan layer of S. aureus. Many virulence factors on the surface of Gram-positive bacteria depend on sortase for attachment to the cell envelope. Therefore sortase-inhibitors have gained interest as antibiotics against resistant strains of S. aureus. Most of these compounds, however, are either of low activity, lack specificity, or display undesirable side-effects that confound therapeutic use.In the present project we aim to explore the strategy of exploiting, instead of blocking, sortase's enzymatic activity for anti-infective purposes.

 

 

Objective of the first part is to create libraries of functionally different peptide-based sortase substrates,

Three libraries will be created, containng:

(i)Poly-ethylene glycol (PEG)-peptide conjugates, in which different types of PEG molecules are tethered to the sortase-recognition motif LPETG. Objective is to generate decoy substrates for sortase, which become incorporated in the peptidoglycan layer of S. aureus, leading to a decreased virulence or lethal destabilization of the cell wall.

(ii)Antimicrobial peptides containing the LPETG motif. Generally, antimicrobial peptides kill bacteria by non-specific membrane disruption. By inserting the LPETG motif in antimicrobial peptides, it is aimed to target these preferentially to sortase, resulting in their accumulation at their cellular target, the microbial membrane.

(iii)Linear inactive precursors to antimicrobial peptides, which in situ are activated by sortase-mediated cleavage or cyclization. Objective is to generate on the spot membrane-disrupting activity.

These libraries will initially be screened with recombinant sortase to select members that are most susceptible for processing by sortase.

 

In the next part the interaction of selected compounds with S aureus and MRSA, and the consequences for their in vitro and in vivo virulence will be explored:

 

The following research questions will be addressed:

 

- Do decoy sortase substrates abrogate exposure on the cell surface of physiological sortase substrates, such as protein A?

- Are decoy substrates in situ processed by sortase?

- Do these substrates exert growth inhibitory/killing effects against S aureus and MRSA, in vitro, ex vivo and in vivo?

 

Objective is to obtain proof of principle that sortase can be used as an effector of anti-bacterial activity, and to obtain insight in the applicability of synthetic pseudosubstrates for sortase for anti-infective purposes.

Naar boven
Direct naar: InhoudDirect naar: NavigatieDirect naar: Onderkant website