Verslagen

Eindverslag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Bacteriën kunnen resistent worden tegen bètalactam antibiotica (penicillines) door hun 3-4 peptide dwarsverbindingen te vervangen door 3-3 dwarsverbindingen in de peptidoglycanlaag in hun celwand die de bacterie vorm geeft en beschermt tegen mechanische stress. De peptidoglycanlaag is een gesloten netwerk van suiker ketens die onderling verbonden zijn door peptide zijketen. Er was nauwelijks iets bekend over de enzymen (LD-transpeptidasen of LD-TPases) die verantwoordelijk zijn voor het maken van de 3-3-binding. Het NAPLCI-consortium bestond uit wetenschappers uit Engeland, Nederland, Frankrijk en Canada. Het consortium wilde bepalen waarom en hoe bacteriën resistent kunnen worden door 3-3 dwarsverbinding te gebruiken. Wat waren de vereisten van de LD-TPases om de dwarsverbinding te kunnen maken en te bepalen welk deel van hun substraat essentieel was voor de enzymatische activiteit door varianten van het substraat te synthetiseren. Om te bepalen waarom de cellen 3 LD-TPases hebben en wat hun normale functie zou kunnen zijn als bacteriën niet resistent hoeven te zijn tegen bètalactam antibiotica. Uiteindelijk een test ontwikkelen die kan worden gebruikt om antibiotica te screenen tegen deze LD-TPases.

Resultaten
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Nederlandstalig

Deze korte tekst wordt gepubliceerd op de website van ZonMw en dient begrijpelijk te zijn voor een breed publiek. Probeer uw tekst te beperken tot 10 à 15 regels.

 

De bacterie Escherichia coli werd resistent gemaakt door ze te laten groeien in de aanwezigheid van Ampicilline terwijl één van de LD-TPases overgeproduceerd werd. Analyse van de resistente stam onthulde dat voor de activiteit van het 3-3-vernettingsenzym, ook de transglycosylase-activiteit van PBP1B en de carboxypeptidase-activiteit van PBP5, die de peptideketen verkort die verknoopt zodat het als substraat kan dienen. Langzame groei was ook een vereiste voor resistentie. Dit past in het groeigedrag van pathogene soorten die een zeer hoog percentage 3-3 cdwarsverbinding in hun peptidoglycaanlaag hebben. Het bleek dat de 3 LD-TPases verschillende activiteiten bij verschillende pH hadden en dat één van hen de andere activeerde. Dit is duidelijk van nut als de bacteriën in verschillende omgevingen moeten overleven. We toonden aan dat de normale functie van de LD-TPases de reparatie van gaten in de peptidoglycaanlaag zou kunnen zijn. Een reeks substraten werd chemisch gesynthetiseerd door onze collega's in Frankrijk en ze testen momenteel welk substraat het beste werkt voor de verschillende LD-TPases. Uiteindelijk hebben we een test ontwikkeld om de activiteit van LD-Tpasen in levende cellen en ook buiten de cel biochemisch te meten. De eerste test kan worden gebruikt om antibiotica te screenen.

 

Voortgangsverslag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Gram negatieve bacteriën hebben een celenveloppe die bestaat uit een binnenmembraan en een buitenmembraan. In de ruimte tussen beide membranen (periplasma) bevindt zich de peptidoglycan(PG) laag. Deze laag bestaat uit een netwerk van suikerketens die onderling verbonden worden door peptide dwarsverbindingen. De PG laag geeft de bacterie vorm en beschermt tegen osmotische en mechanische stress. Penicilline Bindende Eiwitten (PBPs) maken de PG laag in het periplasma. Penicillines ook wel beta-lactams genoemd, remmen de D,D-transpeptidase activiteit van de PBPs waardoor de bacteriën door de interne osmotische druk uit elkaar knallen (lyseren). Helaas zijn veel bacteriesoorten resistent tegen de beta-lactams. Deze bacteriën gebruiken L,D-transpeptidases (TPase) om peptidoglycaan te maken. Sommige pathogene bacteriën, zoals Mycobacterium tuberculosis of Clostridium difficille gebruiken uitsluitend L,D-TPases om PG te maken. De PBPs en de L,D-(TPase) binden twee stukken PG tegelijkertijd en koppelen die aan elkaar. Het ene stuk PG wordt door de acceptor bindingplaats van het eiwit gebonden en het andere stuk PG door de donor bindingsplaats van het eiwit. De acceptor bindende plaats van PBPs en L,D-TPase zijn hetzelfde maar de donor bindende plaats is anders, daardoor remmen beta-lactams wel PBPs maar niet L,D-TPasen. Het NAPCLI project heeft een bacteriestam gemaakt die afhankelijk is van de L,D-TPase YcbB voor het groeien in aanwezigheid van beta-lactams. Deze stam kan gebruikt worden voor het zoeken naar remmers van de acceptorbindende plaats van L,D-TPases. De verwachting is dat deze ook PBPs zullen remmen. Vooralsnog hebben we deze stam gemaakt en bewezen dat deze stam afhankelijk is van de drie verschillende enzymen waaronder YcbF voor het overleven van groei in aanwezigheid van ampicilline. Daarnaast is langzame groei ook een eis voor het overleven.

 

Resultaten
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

1 De Escherchia coli stam M1 is gemaakt met als doel deze te kunnen gebruiken voor het zoeken naar remmers van de acceptorbindendeplaats van PBPs en L,D-tranpeptidasen. De stam is Ampicilline resistent in aanwezigheid van YcbB.

2 YcbB is de enige L,D-TPase die deze functie kan vervullen. De 5 andere L,D-TPases aanwezig in het genoom van E. coli kunnen dit niet.

3 De stam gebruikt de transglycosylase activiteit van PBP1B, de carboxypeptidase activiteit van PBP5 en de TPase activiteit van YcB om PG te maken.

4 De stam is alleen resistent wanneer deze langzaam groeit. Genoom analyse heeft laten zien dat een isoleucine tRNA synthetiserend gen niet goed meer werkt. Hierdoor denken de cellen dat er voedselgebrek is en zetten ze de “stringent response” aan. Deze zorgt dat de cellen langzaam gaan groeien.

5 Nu deze stam gekarakteriseerd is, kunnen we een screening assay gaan opzetten voor het zoeken naar remmers van de acceptorbindende plaats van PBPs en L,D-TPases.

6 Voor een screening assay zijn positieve en negatieve controles nodig zoals een stam zonder L,D-TPases en donorbindingsplaats en acceptor bindingsplaats mutanten van YcbB. Deze zijn gemaakt, behalve de laatste.

7 Een assay dat de activiteit van YcbB zichtbaar maakt met fluorescentie microscopie is ontwikkeld.

 

Samenvatting van de aanvraag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Peptidoglycan (PG) is an attractive and validated target for antibacterial drug development for two main reasons. First, it is an essential and unique bacterial cell wall polymer with no counterpart in human cells, minimizing the risk of drug toxicity. Second, the essential PG synthases are exposed at the outer surface of the cytoplasmic membrane, making them highly accessible for antibiotic inhibition. Formation of the PG network requires glycosyltransferases for glycan chain elongation and transpeptidases for peptide cross-linking. Transpeptidation involves two stem peptides that act as acyl donor and acceptor substrates, respectively. The acyl donor site is targeted by the β-lactams, which form covalent adducts, and this interaction is well characterized. In contrast, nothing is known on the interaction of the transpeptidases with the acceptor substrate. To combat the erosion of the activity of β-lactams, we propose to identify additional drugable sites in the transpeptidases, including the acceptor binding site, and develop lead antibacterial agents acting on these sites. Our first objective is to characterize the mode of recognition of the acyl acceptor by transpeptidases and identify compounds blocking the binding of this substrate. We will use NMR spectroscopy to map the acceptor site and develop specific inhibitors based on modeling and virtual screening. Our second objective is to identify the partners of transpeptidases that regulate the coordinated elongation of glycan chains and cross-linking of stem peptides. This will allow us to select additional drugable sites in transpeptidases and associated proteins within the PG polymerization complexes. We will map key interactions by FRET analyses in live bacteria producing fluorescent proteins and by in vitro transpeptidase/glycosyltransferase assays in complexes obtained by tandem-affinity purification. Microfluidic cultures and time-lapse microscopy will assess the impact of inhibitors on cell division and viability. The interaction of lead compounds with their targets will be characterized by X-ray crystallography. These complementary approaches will enable the consortium to develop novel strategies for transpeptidase inhibition and obtain leads active against β-lactam-resistant bacteria.

Naar boven
Direct naar: InhoudDirect naar: NavigatieDirect naar: Onderkant website