Verslagen

Eindverslag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Mycobacterium tuberculose is de veroorzaker van tuberculose (tbc), een ziekte die verantwoordelijk is voor bijna 1,5 miljoen sterfgevallen per jaar. In de afgelopen jaren zien we een grote toename van verschillende antibiotica-resistente stammen, waardoor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen een belangrijke prioriteit is geworden. Een belangrijk nadeel van de meeste bestaande en nieuwe tbc-antibiotica is dat ze gericht zijn op één enkel molecuul, wat de kans op resistentieontwikkeling aanzienlijk vergroot. In dit project hebben we ons gericht op type VII secretie (T7S) systemen als veelbelovende nieuwe aangrijpingspunten voor antibiotica. T7S-systemen worden door M. tuberculose gebruikt om eiwitten uit te scheiden. Interessant is dat de tuberkelbacil verschillende T7S-systemen produceert, waarvan er drie essentieel zijn voor de levensvatbaarheid of de virulentie van de bacterie. Om T7S-systemen aan te pakken, hebben we een cel-gebaseerde secretie test ontwikkeld. Met behulp van deze test zijn we erin geslaagd om vijf nieuwe klassen van kleine moleculen te identificeren die de secretie remmen, terwijl T7S-onafhankelijke eiwitten nog steeds werden geproduceerd. We hebben vervolgens een van deze moleculen geoptimaliseerd om stoffen te identificeren die werken in hele lage hoeveelheden. Sommige van deze stoffen zorgen er voor dat de bacterie bestreden wordt op de plek waar het belangrijk is, namelijk in geïnfecteerde gastheer cellen en in geïnfecteerde dieren. Het doel is nu om het middel verder te optimaliseren.

Resultaten
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Als onderdeel van een internationaal consortium hebben we ons gericht op stoffen die het ESX-5 systeem remmen, terwijl onze partners aan de andere ESX systemen werkten. We hebben een assay ontwikkeld op basis van een zeer actief lipase dat ook een ESX-5 substraat is. In nauwe samenwerking met de EPFL (Lausanne) hebben we een bibliotheek van 32.000 verbindingen gescreend. Een tweede test werd gebruikt om lipaseremmers uit te sluiten en daarna hebben we immunoblots gebruikt om ESX-5-remming te bevestigen. Zoals voorspeld, blokkeerden de meeste van onze stoffen de groei van de tuberculosebacil. Na het testen van toxiciteit op verschillende eukaryote cellen, en het testen van dosis - reactieanalyse en chemische analyse, hebben wij nu vijf klassen van verbindingen die alle nieuw zijn en druglike, bovendien werken ze in micromolaire hoeveelheden (1-10 μM). Al deze verbindingen werden opnieuw gesynthetiseerd en er werden ook tot 50 verschillende versies geproduceerd. Belangrijk is dat deze verbindingen ook in vivo actief bleken te zijn, omdat ze de groei van vissentuberculose bacteriën in een zebravisinfectiemodel blokkeerden. Zoals verwacht, blokkeerden deze verbindingen de groei van andere bacteriën niet, ze zijn specifiek voor de tuberkelbacil en nauw verwante soorten. Een van de geïdentificeerde verbindingen remt ook ESX-1 secretie, wat in lijn is met ons doel van "één geneesmiddel dat meerdere eiwitten blokkeert". Het is bekend dat het blokkeren van twee belangrijke eiwitten tegelijkertijd de resistentieontwikkeling aanzienlijk vermindert.

Voortgangsverslag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Mycobacterium tuberculosis is de veroorzaker van tuberculose (TB), een ziekte die bijna 1,3 miljoen mensen ieder jaar het leven kost. Met het noTBsec project zullen we moleculen identificeren die zijn gericht tegen meerdere homologe doelwitten van de tuberkelbacterie. De theorie hierachter is dat, door het blokkeren van meerdere homologe doelwitten met een enkel molecuul, we de ontwikkeling van resistentie aanzienlijk kunnen verminderen. We hebben gekozen voor het type VII secretie (T7S) systemen als doelwit. Met behulp van T7S systemen worden door M. tuberculosis eiwitten uitgescheiden naar het celoppervlak of in de gastheer. Interessant is dat deze bacterie verschillende T7S systemen heeft, waarvan er drie essentieel zijn voor de levensvatbaarheid of virulentie van de bacterie. Om T7S systemen te kunne uitschakelen, benutten we de gedetailleerde kennis van T7S systemen die onlangs is gegenereerd binnen het consortium. Om de activiteit van onze nieuwe moleculen te verhogen, zullen we ook moleculen zoeken die synergetisch werken. Dit doen we door gebruik te maken van alle bekende antibiotica en andere FDA-goedgekeurde geneesmiddelen. Vervolgens zullen (combinaties van) moleculen in vivo worden getest in een diermodel voor de activiteit, de toxiciteit en de ontwikkeling van resistentie. We zijn erin geslaagd om een reproduceerbare en betrouwbare high-throughput screen op te zetten voor een van deze T7S systemen en hebben deze screen gebruikt om meer dan 30.000 verschillende moleculen te testen. Na twee extra stappen hebben we nu 54 moleculen geïdentificeerd die goed de secretie remmen met een relatief lage concentratie. Deze verbindingen zijn inmiddels besteld en zullen in meer detail onderzocht worden.

Resultaten
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Door middel van uitgebreide en gedetailleerde analyse hebben we alle T7S eiwitten die cruciaal zijn voor de secretie geïdentificeerd. We hebben gebruik gemaakt van een high throughput screening om moleculen die T7S systemen remmen te identificeren. Voor ESX-5, heeft het Bitter laboratorium in Amsterdam (VUmc) een test ontwikkeld gebaseerd op de activiteit van één van de ESX-5 substraten, namelijk lipase LipY. LipY is de actiefste en overvloedige lipase die uitgescheiden wordt door mycobacteriën en waarvan de secretie afhankelijk is van een actief ESX-5 systeem. Door gebruik te maken van een fluorescent substraat kunnen we gemakkelijk de aanwezigheid van Lipy meten op het oppervlak van mycobacteriën en dit zelfs in multiwell microtiter platen. Om veiligheidsredenen, hebben we geen gebruik gemaakt van Mycobacterium tuberculosis, maar een nauw verwante bacterie Mycobacterium marinum. Deze bacterie is de veroorzaker van tuberculose in vissen, maar veroorzaakt geen systemische ziekte bij mensen en daarom kunnen we werken bij een gemiddeld veiligheidsniveau. Het eerste dat we gedaan hebben, was een optimalisatie van de lipase-test, zodat we betrouwbaarder en reproduceerbaar konden testen op lipase-activiteit. De belangrijkste parameters waren de incubatietemperatuur, het schudden van de platen, de incubatietijd, het volume etc. Uiteindelijk hadden we condities gevonden die goed genoeg waren voor een high throughput screen. Wij combineerden deze screen met een leven-dood test, om te achterhalen welke moleculen direct de bacterie doden (zonder lipase secretie te blokkeren). Toen deze twee screens voldoende werkten, gingen we samenwerken met de EPFL in Lausanne, waar een screening platform aanwezig was met pipetteerrobots en een grote collectie van chemische moleculen. In totaal zijn er 31,999 moleculen gescreend uit twee verschillende bibliotheken. In totaal vertoonden 175 moleculen een reproduceerbare en significante daling van lipase activiteit, wat een percentage van 0,55% is. Verdere testen verminderde het aantal interessante moleculen tot 98. Het volgende dat werd getest was of deze moleculen ofwel de oppervlakte lokalisatie van LipY remmen dan wel de activiteit van LipY beletten. Deze test toonde aan dat 44 moleculen in feite lipase-remmers zijn en derhalve niet de moleculen die we zochten. Dit laat ons 54 moleculen over voor de vervolgproeven. Al deze moleculen vertoonden een dosis-afhankelijke activiteit. De meest actieve moleculen zijn nu in grotere hoeveelheden aanwezig en worden momenteel getest voor hun effect op eiwitsecretie.

Samenvatting van de aanvraag

Samenvatting
Dit item is dichtgeklapt
Dit item is opengeklapt

Mycobacterium tuberculosis is the causative agent of tuberculosis (TB), a disease responsible for almost 1.3 million deaths per year. In recent years, different classes of drug resistant M. tuberculosis strains have emerged, making the discovery of novel anti-TB drugs a major global priority. This awareness has resulted in several new initiatives to find new (classes of) antimicrobial compounds. One of these initiatives is NM4TB, a consortium containing two noTBsec members, which discovered the benzothiazinones as promising new antimycobacterial compounds. A major disadvantage of most existing and new TB compounds is that they target a single molecule, which significantly increases the chance that resistant strains will emerge. In this project, we will address this problem by identifying compounds that target multiple type VII secretion (T7S) systems. T7S systems are used by M. tuberculosis to secrete proteins across the cell envelope to the cell surface or into the host environment. Interestingly, this bacterium has several different T7S systems, three of which are essential for viability or virulence. We predict that, by blocking multiple T7S systems with a single compound, we will considerably reduce the development of drug resistance. To target T7S systems, we will use two complementary approaches to identify: (i) secretion blockers based on secretion activity assays and (ii) compounds designed to target specific T7S components. As proof of principle, we have already successfully used the first approach to identify two different classes of compounds that block T7S systems. Importantly, one of these compounds significantly reduced mycobacterial growth in vivo. For the second approach we will exploit the detailed knowledge of T7S systems that has been recently generated within the consortium, including structures of several crucial druggable components. To increase the activities of our secretion-blocking compounds, we will also identify compounds that act synergistically with them from libraries of antibiotics and other FDA-approved drugs. Subsequently (combinations of) compounds will be tested in vivo in a high throughput animal model for activity, toxicity and resistance development. Together, these experiments will identify molecules inhibiting T7S secretion. These will be used to test the concept that by inactivating multiple essential targets, the emergence of drug resistance is reduced.

Naar boven
Direct naar: InhoudDirect naar: NavigatieDirect naar: Onderkant website