Mobiele menu

High throughput and comprehensive resequencing of cardiomyopathy genes by CHIP based DNA-sequencing technology (CardioCHIP)

Projectomschrijving

De CardioCHIP is een snelle, betrouwbare en goedkope methode om de genetische oorzaak van erfelijke afwijkingen aan de hartspier (cardiomyopathieën) op te sporen. Dit blijkt uit onderzoek uit het MUMC+.
Het is voor patiënten en hun familieleden wezenlijk om de oorzaak ervan te kennen, voor behandeling en preventie. De conventionele manier voor dit genetisch onderzoek is opsporing van eventuele afwijkingen (mutaties) in betrokken genen door de volgorde van bouwstenen in het DNA te bepalen. Deze zogeheten sequentie-analyse is echter tijdrovend en kostbaar, waardoor in de klinische praktijk slechts een deel van de mogelijke genen kan worden onderzocht. De CardioCHIP bepaalt gelijktijdig de mutaties in 34 genen en blijkt 22 keer sneller en 12 keer goedkoper zonder dat mutaties worden gemist. De onderzoekers willen een professionele database ontwikkelen die toegankelijk is via het internet. Op deze manier wordt de dataset, die uniek is om het aantal genen en patiënten, wereldwijd beschikbaar voor verder wetenschappelijk onderzoek en patiëntenzorg.

Verslagen


Eindverslag

Erfelijke cardiomyopathieën zijn frequente, vaak fatale hartspieraandoeningen met een voorkomen van 1 op 500 (hypertrofische cardiomyopathie of HCM) tot in 1 in 2500 (gedilateerde cardiomyopathie of DCM). Door het grote aantal genen dat deze aandoeningen kan veroorzaken, de heterogeniteit van de klinische expressie en de tijdrovende laboratoriumonderzoeken is het moeilijk om in elke patiënt snel de genetische oorzaak te achterhalen. De huidige diagnostische protocollen lossen ongeveer 60% van de families op door een beperkt aantal genen na elkaar te testen, wat een zeer tijdrovend proces is. Meestal stopt men ook als een pathogene mutatie is gevonden. Het wordt echter steeds duidelijker dat meer dan 1 mutatie kan voorkomen en dit is al gerapporteerd voor 5-10% van de families. Daarom hebben wij een CardioCHIP ontwikkeld, waarmee snel en gelijktijdig 34 genen op mutaties kunnen worden onderzocht in patiënten met cardiomyopathie. Op deze CHIP staan alle genen, waarvan bekend is dat deze gemuteerd kunnen zijn bij erfelijke cardiomyopathieën, en een aantal kandidaatgenen op basis van hun rol in de hartspier (sarcomeer- en Z-disc-eiwitten). Alle exonen en een deel van de flankerende intronen van hart- en spierspecifieke isovormen zijn op de CHIP aangebracht. Ook de 5’ en 3’ UTR’s en een deel van de promoter-regio’s staan erop. De genen, die getest worden met de CardioCHIP, worden geamplificeerd met behulp van 152 long-range PCR-reacties, die 395 exonen omvatten en 146.541 nucleotiden per patiënt opleveren. In totaal zijn 256 patiënten met de CardioCHIP voor alle genen onderzocht. Ongeveer 125.000 varianten zijn gevonden in het hele cohort, wat ongeveer 488 varianten per patiënt betekent. Van de bekende mutaties wordt 99% opgepikt en van de nieuwe met de CardioCHIP gevonden mutaties wordt 98% bevestigd met conventionele sequentieanalyse. De gevonden varianten zijn opgeschoond voor bekende polymorfismen en waarschijnlijk neutrale varianten, waardoor een aantal van 540 varianten overblijft die pathogeen zijn of waarschijnlijk pathogeen, zgn unclassified variants (UVs). Dit laatste is gebaseerd op genetische en functionele pathogeniciteitscriteria. Een pathogene mutatie of UV is gevonden in circa 80% van de patiënten, in 20% is geen mutatie aangetoond. Ongeveer de helft van de eerste groep patiënten heeft meer dan 1 mutatie of UV in een van de genen en een beperkt aantal zelf 5 of meer. Dit geeft aan dat meerdere mutaties of UVs per individu veel vaker voorkomen dan oorspronkelijk gedacht en dat verschillende mutaties en ziektebeelden in de familie van dergelijke patiënten kunnen segregeren. Voor een accurate prognose en om misinterpretaties te voorkomen is het wezenlijk alle genen te testen in alle patiënten en niet alleen voort te borduren op het eerste geïdentificeerde defect, zoals op dit moment gebeurt. Ongeveer 44% van alle mutaties wordt gevonden in 2 genen, maar de rest (36%) is versnipperd over 31 genen, wat aangeeft dat elk van deze genen verantwoordelijk is voor slechts een klein deel ervan en dat gelijktijdige analyse van alle genen noodzakelijk is om deze defecten snel op te kunnen sporen. De CardioCHIP is ongeveer 22 keer sneller en 12 keer goedkoper dan conventionele sequentieanalyse. Onze data tonen aan dat de CardioCHIP een snelle, betrouwbare en goedkope methode is om veel genen tegelijkertijd op mutaties te onderzoeken. Dit is een absolute voorwaarde voor genetisch heterogene aandoeningen, zoals erfelijke cardiomyopathieën, om snel en volledig alle genetische oorzaken in patiënten en verwanten met een genetisch risico te kunnen bepalen, waarmee accurate prognoses en verantwoorde preventieve behandelingen mogelijk en gelegitimeerd worden.

Cardiovasculaire aandoeningen vormen doodsoorzaak nummer 1 in de Westerse wereld. Elf procent komt door hartfalen, gedeeltelijk veroorzaakt door erfelijke cardiomyopathie. Genetisch onderzoek is niet eenvoudig, omdat een specifieke relatie tussen kliniek en gendefect ontbreekt en additionele mutaties de manifestatie van het primaire genetische defect beïnvloeden. Snelle diagnostiek, identificatie van individuen met een genetisch risico en actuele prognose op basis van alle gendefecten zijn wezenlijk voor deze potentieel fatale aandoeningen en de rechtvaardiging van agressieve behandelingsmethoden. Daarom zetten wij een een nieuw CHIPs-platform op om snel en compleet 34 kandidaatgenen te testen op mutaties. Dit project vormt een eerste stap naar individuele gezondheidszorg op basis van genetische constitutie.

In totaal zijn 34 genen geselecteerd voor de Cardio-CHIP (ACTC, ACTN2, CAPN3, CSRP3, DES, DTNA, GLA, JPH2, LAMP2, LDB3, LMNA, MYBPC3, MYH7, MYL2, MYL3, MYL7, MYOT, MYOZ1, MYOZ2, MYPN, PLN, PRKAG2, TAZ, TCAP, TMOD1, TMPO, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1, TRIM63, VCL, CAV3, PDLIM3) op basis van gepubliceerde mutaties in deze genen en/of functionele overeenkomsten, m.n. wat betreft het sarcomeer en cytoskelet. Van deze genen worden alle coderende, niet-coderende en alternatieve exonen en 38bp van het intron op de CHIP gezet en van 8 genen ook nog 500bp promotersequentie. Twee MYBPC3 founder-mutaties zijn eveneens toegevoegd. Alle sequenties zij vrij gemaakt van repeats en staan in duplo op de CHIP om de “call-rate” te verhogen.

In totaal zijn 149 long-range PCRs geoptimaliseerd om de genen op de Cardio-CHIP te onderzoeken. Het PCR Extender systeem (5Prime) en de Advantage GC Genomic LA polymerase mix (Clontech) zijn geselecteerd op basis van prestaties en prijs. Wij hebben 2 protocllen ontwikkeld, die als back-up van elkaar kunnen dienen. Alle protocollen werken onder dezelfde condities, waarmee opschaling en automatisering mogelijk wordt, zodat 47 monsters in 1 keer kunnen worden getest. De protocollen werken ook op DNA dat geamplificeerd is via “whole genome amplification” (Repli-g mini). Dit is m.n. van belang omdat voor de long-range PCR 3800ng DNA nodig is per patiënt. Voor whole genome amplification is slechts 10ng nodig. Dit speelt een rol in geval een patiënt overleden is en de hoeveelheid DNA eindig is. Omdat long-range PCR duur is hebben wij de kosten gereduceerd door de hoeveelheid reactiemix en enzym te verminderen zonder de prestaties aan te tasten. Slechts 8 reacties zijn nog niet helemaal optimaal, maar dit betreft slechts een paar GC-rijke exonen. Deze zullen buiten de eerste experimenten worden gelaten en worden later in het project verder geoptimaliseerd.

Een technische test van de resequencing CHIPs is uitgevoerd op een kleinere DCM-CHIP met 11 genen, die wij van onze partner (S. Waldmüller, Dortmund) hebben gekregen. In totaal 14 CHIPs zijn getest met onze long-range producten en vergeleken met conventionele sequentieanalyse. De gemiddelde “call-rate” is 92,06% en de op basis van conventionele sequencing bekende mutaties en SNP's werden gedetecteerd m.b.v. de CHIP.

Alle 250 te testen patiënten zijn geselecteerd uit onze biobank. Tot dusver zijn slechts 4 Cardio-CHIPs in duplo gerund under 2 scanning-condities. Er is voor 2 condities gekozen om ook kwantitatieve verschillen te kunnen oppikken t.g.v. niet-hybrisieren van de probe in geval van deleties of inserties. De gemiddelde “call rate” is 91,46%, maar dit kan verbeterd worden door de software settings aan te passen en meer CHIPs te runnen als vergelijking. Momenteel zijn wij bezig met de data-analyse en de vergelijking met de conventionele sequenties. Een database is gemaakt voor elk van de 34 genen om de enorme hoeveelheid data efficiënt te kunnen hanteren.

Het project is gepresenteerd in locale meetings in Maastricht en nationaal in ICIN-verband. Een lezing "The pros and cons of resequencing CHIPs for the diagnosis of inherited cardiomyopathies" is ge

Samenvatting van de aanvraag

Objective(s)/research question: Cardiovascular disease is the primary cause of death in Western societies, in 11% due to heart failure, partly caused by inherited cardiomyopathies. Genetic testing is not straightforward, as phenotype-genotype-based protocols are not feasible and additional mutations modify the outcome of the primary genetic defect. Rapid diagnosis, identification of (asymptomatic) gene carriers and accurate prognosis based on all genetic factors are important for these life-threatening disorders, also to justify aggressive and costly therapeutic interventions. We will evaluate a rapid and comprehensive CHIP-based resequencing platform to screen 26 candidate genes completely for mutations in patients and their relatives. This will lead to the identification of the underlying pathogenic mutation(s) and it will yield an essential database of pathogenic mutations, polymorphisms and unclassified variants, which will be a first step to establish genome-based personalised health-care. Study design: A CardioCHIP will be developed to resequence 26 candidate genes in a group of 250 patients with familial cardiomyopathy (FCM) and sudden cardiac death (SCD). Study population(s)/datasets: 200 patients with FCM and SCD, but no genetic diagnosis, and 10 mutations for 5 patients each, with different symptoms. Intervention: - Outcome measures: 1. A comparison of the CardioCHIP and conventional sequence analysis with respect to speed, call rate and detection rate of mutations. 2. A genetic diagnosis in the majority of families. 3. Combinations of mutations in patients, which might explain differences in clinic. 4. A database with all sequence variants identified. 5. A CardioCHIP based DNA-diagnostics protocol. Power/data analysis: Patients are evaluated individually, but the number of CHIPs will allow discrimination between pathogenic mutations and common polymorphisms. New analysis software GSEQ is freely available from Affymetrix. Economic evaluation: The time to reach a genetic diagnosis may decrease by a factor 20 with a decrease of bench costs of a factor 5. The majority of familial cases will be solved and unnecessary life-time monitoring of non-carriers will be prevented. Costly preventive interventions will rely on a more accurate estimate of the genetic risk in carriers. Time schedule: Mo1-9: The CardioCHIPs with 26 genes will be developed, long range PCR protocols optimized and tested for technical peformance. Mo 9-24: Patients will be tested, results evaluated and a protocol defined. Doel / vraagstelling: Cardiovasculaire aandoeningen vormen doodsoorzaak nummer 1 in de Westerse wereld. Elf procent komt door harffalen, gedeeltelijk veroorzaakt door erfelijke cardiomyopathie. Genetisch onderzoek is niet eenvoudig, omdat een specifieke relatie tussen kliniek en gendefect ontbreekt en additionele mutaties de manifestatie van het primaire genetische defect beïnvloeden. Snelle diagnostiek, identificatie van individuen met een genetisch risico en accurate prognoses op basis van alle gendefecten zijn wezenlijk voor deze potentieel fatale aandoeningen en de rechtvaardiging van agressieve behandelingsmethoden. Daarom stellen wij een nieuw CHIPs-platform voor om snel en compleet 26 kandidaatgenen te testen op mutaties. Dit project vormt een eerste stap naar individuele gezondheidszorg op basis van genetische constitutie. Studieopzet: Een Cardio-CHIP wordt ontwikkeld om 26 kandidaatgenen te testen in een groep van 250 patiënten met erfelijke cardiomyopathie en plotse hartdood. Studiepopulatie/databronnen: 200 patiënten met een erfelijke cardiomyopathie, maar zonder DNA-diagnose, 10 mutaties met elk 5 dragers met verschillende kliniek. Interventie: - Uitkomstmaten: 1. Een vergelijking van de CardioCHIP met conventionele sequentie-analyse m.b.t. kwaliteit, snelheid, call rate", detectieniveau en aantal gedetecteerde mutaties. 2. Een genetische diagnose in de meerderheid van de patiënten. 3.Combinaties van mutaties, die mogelijk gerelateerd kunnen worden aan de ernst van de aandoening. 4. Een database met alle geïdentificeerde sequentievarianten in cardiomyopathiegenen. 5. Een DNA-diagnostiekprotocol gebaseerd op de CardioCHIP. Power-/data-analyse: Patiënten worden individueel geëvalueerd, maar het aantal van 200 CHIPs maakt onderscheid mogelijk tussen pathogene mutaties en frequente polymorfismen. Nieuwe gratis analysesoftware GSEQ is door Affymetrix ontwikkeld. Economische evaluatie: De tijd om een genetische diagnose te stellen zal met een factor 20 afnemen met een reductie van materiaalkosten van een factor 5. Hiermee wordt de meerderheid van de families opgelost en wordt onnodige controle van niet-dragers voorkomen. Kostbare therapeutische interventies zullen afgestemd worden op de combinatie van mutaties in een individu. Tijdplanning: Maand 1-9: Ontwikkeling CardioCHIP met 26 genen, optimalisatie "long-range" PCR-protocollen en technische test. Maand 9-24: Het testen van patiënten, evaluatie van resultaten en opstelling van een protocol.

Onderwerpen

Kenmerken

Projectnummer:
94527019
Looptijd: 100%
Looptijd: 100 %
2007
2009
Onderdeel van programma:
Gerelateerde subsidieronde:
Projectleider en penvoerder:
Prof. dr. H.J.M. Smeets
Verantwoordelijke organisatie:
Maastricht Universitair Medisch Centrum+